Главная



Иммунология и вакцинация

Кэппинг и эндоцитоз

Используя меченные флуоресцеином Fab-фрагменты антител к иммуноглобулинам, связанным с мембранами В-клеток, можно увидеть, что иммуноглобулины распределены по поверхности клетки довольно равномерно. Однако если вместо Fab-фрагментов взять бивалентные антитела, способные сшивать молекулы поверхностных иммуноглобулинов, то последние тут же преципитируют в мембране с образованием флуоресцирующих пятен неправильной формы (пэтчей). Ингибировать образование пэтчей можно, лишь используя факторы, уменьшающие текучесть внешнего слоя плазматической мембраны — например, добавляя стеролы или понижая температуру.

За несколько минут образования пэтчей они соединяются с актином и миозином на внутренней стороне мембраны, затем объединяются друг с другом и мигрируют к одному из концов клетки.

В-клетки инкубировали на холоду вместе с антителами против поверхностных иммуноглобулинов,  
отмывали, помещали в чашки для культивирования и инкубировали при 37°С в течение указанного на рисунке времени.

Реакцию останавливали при помощи фиксации параформальдегидом, клетки окрашивали, с тем чтобы изучить распределение поверхностных иммуноглобулинов методом флуоресцентной микроскопии. Диаграмма справа показывает характер распределения флуоресцентных комплексов антител с поверхностными иммуноглобулинами. Графики слева показывают время появления фракций с различным распределением флуоресцентных комплексов. По оси ординат отложено содержание фракции с данным типом распределения флуоресцирующих комплексов. Диффузия — диффузное распределение, колпачок 1/2 — колпачок размером в половину клеточной поверхности, колпачок 1/4 — колпачок размером в одну четверть клеточной поверхности и т. д.

Флуоресценция концентрируется на одном полюсе клетки, напоминая при рассматривании в флуоресцентный микроскоп лунный серп. Поэтому ее называют колпачком (кэпом). Кэп может выдаваться наружу, образуя отросток с неровным краем. Хотя меченные флуоресцеином антитела против иммуноглобулинов способны в течение 10 мин вызывать кэппинг, у 90% В-клеток исчезновение флуоресцирующей области происходит значительно дольше, занимая от нескольких минут до 1 ч. При этом многие В-клетки становятся поразительно подвижными, скользя в направлении, противоположном отростку.

В клетках некоторых типов при кэппинге часть пэтчей впячиваются вовнутрь, образуя сначала окаймленные ямки, а затем окаймленные пузырьки, которые увлекают внутрь материал с поверхности клетки. Этот процесс, называемый эндоцитозом, зависит от системы микрофиламентов. В нормальных лимфоцитах окаймленные ямки не видны, однако под образующимся кэпом часто наблюдаются эндоцитозные вакуоли, где распадаются проникшие внутрь молекулы иммуноглобулинов. Второй механизм исчезновения кластеров поверхностных иммуноглобулинов с мембраны заключается в сбрасывании их в среду, но этот процесс более выражен в бластах, чем в малых лимфоцитах, и не зависит от присоединения лиганда. После кэппинга на клетке некоторое время нельзя обнаружить поверхностных иммуноглобулинов, однако с помощью флуоресцентно-меченных антител было показано, что распределение других поверхностных молекул не нарушается. Постепенно в течение следующих 24 ч зрелая В- клетка синтезирует новые молекулы поверхностных иммуноглобулинов, которые появляются на мембране. В отличие от зрелых лимфоцитов В-клетки новорожденных особей после кэппинга слабо ресинтезируют поверхностные иммуноглобулины. За исключением образования пэтчей и сбрасывания рецепторов, все остальные описанные процессы могут протекать лишь при наличии активлого клеточного метаболизма.

Антигены также могут вызывать кэппинг поверхностных иммуноглобулинов в очень небольших субпопуляциях В-клеток, имеющих соответствующие поверхностные рецепторы (антигенсвязывающие клетки). Кэппинг, вызываемый антигенами, можно обнаружить с помощью методов радиоавтографии (используя радиоактивно меченные белковые антигены), иммунофлуоресценции или же применив видимые антигенные частицы, например чужеродные эритроциты. Рецепторы на поверхности антигенсвязывающих Т-клеток также могут быть собраны в кэп при взаимодействии с антигеном.

Кэппинг не ограничивается лишь поверхностными иммуноглобулинами, или лимфоцитами, или тучными клетками. В клетках многих типов различные интегральные белки наружного слоя плазматической мембраны способны образовывать кэпы, сшиваясь друг с другом за счет соответствующих лигандов или антител. Молекулы клеточной поверхности сильно различаются по способности к кэппингу. Эта способность зависит от прочности их ассоциации с соседними мембранными молекулами, а также их расположения и ориентации в мембране. Такие молекулы, как белки класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС) или Thy-1, в присутствии антител не образуют кэпов, если при этом не добавлены антитела против первых антител для усиления сшивки. Но даже и в этом случае кэппинг идет медленно и не до конца. С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что при образовании кэпа под ним концентрируются сократительные белки актин и миозин. Действительно, имеются данные, согласно которым агрегация поверхностных иммуноглобулинов вызывает их присоединение к цитоплазматическим сократительным микрофиламентам, содержащим актин (возможно, посредстром какого-то связующего белка во внутреннем слое плазматической мембраны), и поэтому сокращение микрофиламентов приводит к кэппингу. В то же время такие молекулы, как антигены класса I МНС или Thy-1, не ассоциируют с сократительными белками. Кэппинг в этих случаях объясняется простой диффузией и слиянием пэтчей друг с другом без активного участия микрофиламентов.

Можно ли считать кэппинг «активационным процессом»? Нет, нельзя, если в качестве критериев активации выбраны синтез ДНК и секреция иммуноглобулинов. Формирование колпачка под действием антител к иммуноглобулинам не влияет на способность клеток селезенки мыши образовывать гемолитические пятна в ответ на антиген. Димерный сукцинил-Кон А вызывает синтез ДНК, не индуцируя при этом кэппинга. Агглютинин из зародышей пшеницы стимулирует кэппинг и некоторые ранние процессы, однако синтеза ДНК по полной программе при этом не наблюдается. То же самое при некоторых условиях можно сказать и про антитела к иммуноглобулинам. Характерно, что оптимальные для кэппинга условия предполагают значительно большие концентрации таких антител (т. е. более высокую степень сшивки поверхностных иммуноглобулинов), чем оптимальные условия для синтеза ДНК. Аналогичным образом концентрации антител к IgE, оптимальные для образования колпачка из Fce- рецепторов на поверхности тучных клеток, значительно выше, чем для высвобождения гистамина (в последнем случае на поверхности клетки появляется лишь небольшой кластер из молекул рецепторов). Подобные сравнения лимфоцитов с тучными клетками наводят на мысль, что, хотя и кэппинг, и активация стимулируются сигналами, возникающими в мембране вследствие сшивки молекул поверхностных иммуноглобулинов, для кэппинга требуется полная преципитация этих молекул с образованием видимых в микроскоп пятен, в то время как для активации необходимо образование лишь небольших локальных агрегатов.

Какая польза клетке от кэппинга, если он, по-видимому, не приводит к активации? Об этом можно лишь гадать. Не исключено, что сигнал к кэппингу представляет собой своего рода «регулировочное устройство». С помощью кэппинга клетка может избавляться от избыточного лиганда и таким образом в течение некоторого времени доводить концентрацию последнего до оптимального для иммунного ответа уровня. Кэппинг может также предотвращать разрушение клетки при взаимодействии с антителами, которые в противном случае могли бы вызвать ее гибель вследствие опсонизации антителозависимой клеточной цитотоксичности или лизиса.

Как может использовать кэппинг иммунолог? Во-первых, кэппинг дает возможность избирательно убрать с клеточной мембраны молекулы одного типа. Во-вторых, образовав с помощью антител, меченных флуорохромом одного типа, кэп из мембранных молекул А, добавив затем ингибитор кэппинга и антитела к молекуле Б, меченные флуорохромом другого типа, можно узнать, соединены ли друг с другом в мембране молекулы А и Б или нет. Антигенные детерминанты, участвующие в кэппинге независимо друг от друга, находятся, очевидно, в разных молекулах, а детерминанты, перемещающиеся при кэппинге совместно (кокэппинг), могут принадлежать одной и той же молекуле или же молекулам, взаимодействующим друг с другом. Например, как было показано, IgM и IgD на поверхности В-клеток образуют кэпы независимо друг от друга, а антигены к поверхностным иммуноглобулинам на антигенсвязывающих клетках — совместно друг с другом. В-третьих, поскольку кэппинг идет всего несколько минут, он служит быстрым индикатором того, что в результате сшивки рецепторов на поверхности мембраны возник сигнал, поступивший в клетку. Использование такого сигнала становится особенно удобным, если учесть, что в сравнении с кэппингом вся программа активации клетки занимает несколько дней и представляет собой крайне сложную совокупность процессов, чтобы ее можно было анализировать шаг за шагом. Тучные клетки, высвобождающие гистамин через несколько минут после сшивки Fce-рецепторов, представляют собой еще одну модель, которая обладает аналогичными преимуществами.

Анализ последовательности этапов, ведущей от сшивки рецепторов к кэппингу, облегчается наличием многих обратимых ингибиторов кэппинга с различными механизмами действия. К таким ингибиторам относятся стеролы (уменьшающие текучесть мембраны), хлорпромазин (транквилизатор, способный, кроме того, вытеснять кальций с внутренней стороны плазматической мембраны), ионофор кальция (белок, интегрирующийся в мембрану и формирующий канал, по которому кальций устремляется внутрь), цитохалазины В и D (затрудняющие ассоциацию сократительных белков в активные микрофила- менты), пропанолол β-адренергический блокатор, затрудняющий также вы-свобождение кальция из саркоплазматического ретикулума скелетной мышцы), дибукаин (используется в качестве местного обезболивающего средства и, кроме того, ингибирует активное поглощение кальция саркоплазматическим ретикулумом, необходимое для поздних процессов сокращения), ингибиторы анаэробного гликолиза, например фториды, и ингибиторы аэробного гликолиза, такие, как азид. Ингибиторы перечислены в той последовательности, в которой они действуют. Эта последовательность изучалась в опытах со следующей схемой. В культуру В-клеток добавлялись меченные флуоресцеином антитела против иммуноглобулинов и один из обратимых ингибиторов. После инкубации первый ингибитор заменяли вторым ингибитором и проводили повторную инкубацию. Если действие первого ингибитора в цепи реакций, составляющих кэппинг, предшествует действию второго ингибитора, то образования кэпов наблюдаться не будет. В противном случае кэпы будут образовываться. Полученные данные показали, что существует линейная последовательность реакций, ведущая от сшивки рецепторов к образованию кэпа. Несомненно, что сигнал, инициирующий кэппинг, должен быть значительно проще, чем активационный «сигнал». По схеме, аналогичной только что приведенной, была изучена цепь реакций, ведущая от сшивки Fce-рецепторов к высвобождению гистамина из тучных клеток.

Помимо приведенных веществ предотвращать кэппинг способны также соединения, ингибирующие трансметилирование, например S-изобутил-З-деазоаденозин. В то же время известные ингибиторы липоксигеназной цепи реакций, синтеза белка и вещества, изменяющие концентрации циклических нуклеотидов, не способны заметно ингибировать кэппинг. Колхицин, связывающийся с субъединицами тубулина, что предотвращает их полимеризацию в микротрубочки, в некоторых условиях усиливает кэппинг, но он также может оказаться потенциальным ингибитором кэппинга, вызываемого неоптимальными концентрациями цитохализинов.

Для ознакомления с литературой, посвященной кэппингу, можно рекомендовать подробные обзоры.