Главная



Иммунология и вакцинация

Будущие вопросы, будущие ответы

Несомненно, что ответы на эти и другие вопросы, касающиеся Т-клеточных рецепторов к антигену и к собственным молекулам, будут в ближайшем будущем получены. Трудно, правда, сказать, когда конкретно это произойдет. В настоящее время во многих лабораториях последовательно проводится в жизнь программа исследований, которая в общих чертах обрисована ниже.

Первый этап, очевидно, заключается в клонировании необходимых Т-клеток, что может быть осуществлено либо выращиванием их in vitro, либо трансформацией вирусом, либо получением клонов гибридных клеток путем слияния с клетками злокачественной Т-клеточной лимфомы. Имеются примеры успешной реализации всех трех способов. Хотя условия выращивания некоторых Т-клеточных популяций изучены уже довольно хорошо, для значительной части Т-клеток еще предстоит получить индивидуальные клоны и охарактеризовать их, а это для начала потребует отработки условий роста неклонированных форм этих клеток. Представляется маловероятным, что все Т-клетки будут одинаково расти в ответ на одни и те же стимулы, а это затруднит регуляцию роста индивидуальных функциональных популяций Т-клеток.

Второй этап сводится к выделению специфических антигенсвязывающих белков из клонированных Т-клеток. Желательно показать, что данные молекулы не только связывают антиген, но также опосредуют какую-либо биологическую функцию, имеющую отношение к функционированию продуцирующей их клетки, так как это гарантирует, что молекула не просто прилипает к антигену, а обладает определенной иммунологической активностью. Хотя первичную структуру белка можно определить быстрее путем выделения и секвенирования кодирующих его фрагментов нуклеиновой кислоты, такие характеристики молекулы, как связывающая активность, структура субъединиц и их взаимное расположение, способность присоединяться к мембране и скорость обмена в разных условиях, могут быть определены лишь при изучении молекулы белка. Для этой цели весьма полезными окажутся моноклональные антитела. Их также можно будет использовать при изучении нормальных популяций лимфоцитов, в том числе в исследованиях in vivo.

Третий этап состоит в выделении информационной РНК, трансляции ее in vitro и доказательстве, что продукты трансляции сохраняют антигенсвязывающую и биологическую активности. Данная система может быть в дальнейшем использована для тестирования набора кДНК. Определив нуклеотидную последовательность клонированной кДНК, можно установить аминокислотную последовательность соответствующего белка, и, кроме того, эту кДНК можно использовать в качестве зонда для идентификации в геноме генов, кодирующих разные участки Т-клеточного рецептора. Другой возможный путь, позволяющий обойти этот этап, связан с использованием зондов для генов VH для идентификации тех кДНК, которые, судя по всему, кодируют рецепторные молекулы. Этот подход предполагает идентичность или гомологию генов, кодирующих Т-клеточные рецепторы, и сегментов F/7-генов. Наконец, с помощью антител против Т-клеточных антигенсвязывающих белков, возможно, удастся идентифицировать молекулы, образующиеся при трансляции in vitro, что дает, следовательно, еще один способ тестирования набора кДНК.

Если кДНК-зонд получен, то на уровне ДНК можно решать много разных задач. Помимо выделения и секвенирования генов, участвующих в формировании Т-клеточных рецепторов, хотелось бы знать, в каких хромосомах находятся фрагменты, кодирующие разные участки Т-клеточного рецептора, и имеют ли отношение к данному рецептору гены, о которых известно, что они кодируют антигенсвязывающие белки в других системах (например, иммуноглобулины). Поскольку гены иммуноглобулинов прежде, чем начать экспрессироваться, претерпевают перестройку, хотелось бы знать, используется ли в Т-клетках подобная стратегия, и если да, то включает ли она в себя перенос фрагментов ДНК из одной хромосомы в другую. Последний вопрос возник после того, как обнаружилось, что в хромосоме 12 кодируются идиотипические или аллотипические детерминанты тех молекул, которые несут также I-J-детерминанты, кодируемые хромосомой 17. Хотя в настоящее время считается, что в соматических клетках эти гены не переходят из одной хромосомы в другую, тем не менее, поскольку видимых препятствий для таких переходов нет, такую возможность необходимо учитывать. Явилось же полной неожиданностью, когда было обнаружено, что молекулы антител собираются из отдельных фрагментов, объединяющихся друг с другом в соматических клетках при перестройках ДНК. Наконец, кДНК-зонды можно будет с успехом использовать при изучении развития и дифференцировки Т-клеток. Выполняют ли Т-клетки, подобно В-клеткам, ряд функций, определяемых генами константной области, и изменится ли функция Т-клеток, специфичных к какому-либо антигену, в результате перестроек генов, которые приводят к экспрессии комбинированного антигенного рецептора, перестроенного таким образом, чтобы получилась новая функциональная константная область?

Альтернативный подход заключается в конструировании гибридных клеток, содержащих искусственно введенные гены Т-клеток. Трансфекция L-клеток или ооцитов Т-клеточной ДНК и последующее тестирование в этих клетках экспрессии продуктов, кодируемых введенным фрагментом ДНК, могут в принципе привести к быстрому выделению желаемого фрагмента ДНК. Этот подход, имеет преимущество при изучении клеточных функций, которые могли бы утратиться при необходимости использования растворимого продукта. При использовании данного подхода клетка, несущая селектируемый маркер, трансформируется одновременно неким геном, использующим дефект генома клетки-хозяина и тотальной ДНК из Т-клеток, имеющих идентифицируемый рецептор. Из выживших клеток отбираются такие, которые экспрессируют со-ответствующий маркер.

Хотя такие перспективы молекулярно-генетического анализа Т-клеточных рецепторов кажутся весьма привлекательными, на некоторые вопросы можно получить более точные ответы с помощью других методов. Так, наличие Т-клеточных «изотип»-специфических реагентов или моноклональных антител позволяет выделить, охарактеризовать и клонировать эти клетки, а также уменьшать или увеличивать их содержание в клеточных популяциях, а это в свою очередь представляет собой единственный способ изучения связи структуры и функции на популяционном уровне, поскольку проведение молекулярно-генетического анализа предполагает гибель клетки. Кроме того, в некоторых случаях, чтобы определить функцию белков, необходимо знать их внутриклеточную локализацию. Например, пре-В-клетки синтезируют ц,-цепи, но не используют их в качестве поверхностных рецепторов, что было легко показано с помощью антител.

В заключение необходимо признать, что Т-клеточный рецептор ныне так же неуловим, как и 10 лет назад. Мы не знаем ни его структуры, ни генов, которые его кодируют. Ситуация в некотором смысле стала даже более сложной, поскольку теперь мы понимаем, что Т-клетки отличаются большим разнообразием и что их антигенсвязывающие молекулы также могут сильно отличаться друг от друга. Тем не менее значительные успехи, достигнутые в этой области, вселяют веру в то, что в ближайшее же время в исследовании структуры Т-клеточных рецепторов и их разнообразия будет сделан существенный шаг вперед. Важнейшими направлениями исследований являются идентификация генов, кодирующих компоненты Т-клеточного рецептора, и изучение генетических процессов, ведущих к образованию функциональных рецепторов, а также анализ узнавания Т-клетками своих МНС-молекул и роли Т-клеточных изотипов в функциях Т-клетки. При таком анализе необходимо все время иметь в виду очень большую гетерогенность Т-клеток, так чтобы избежать догматических утверждений о Т-клеточном рецепторе вообще. Клонирование антителообразующих клеток (имеется в виду получение гибридом), функциональных Т-клеток и фрагментов нуклеиновых кислот, по-видимому, позволит в будущем полностью решить данную проблему.