Главная



Иммунология и вакцинация

Гены иммуноглобулинов: хромосомы и рак

Известен класс перестроек в гене Ig, отличный от уже рассмотренных, и, видимо, связанный со злокачественной трансформацией тех клеток, в которых эти гены активны, т. е. В-лимфоцитов. Некоторые данные, указывающие на связь между генами Ig и раком В- клеток, были получены при хромосомном картиро-вании этих генов.

До наступления эры рекомбинантных ДНК классические методы генетики позволили локализовать некоторые гены Ig в определенных хромосомах, продемонстрировав генетическое сцепление аллотипов с известными хромосомными маркерами. Новые методы, использующие клонированные гены, подтвердили и расширили эти представления. Один из многообещающих методов состоит в получении гибридных клеток путем слияния, например, человеческих клеток с культивируемыми клетками мыши. Поскольку такие гибридомы утрачивают преимущественно человеческие хромосомы, при субклонировании можно получить набор различных гибридных линий, каждая из которых сохраняет те или иные человеческие хромосомы. Затем, используя гибридизацию ДНК с клонированными генами человека, можно установить, какая из гибридных линий содержит клонированный ген. (Перекрестная гибридизация с гомологичными генами мыши обычно не создает трудностей, так как мышиные и человеческие гены можно различить методом блоттинга по Саузерну по различиям в сайтах рестрикции во фланкирующих последовательностях). Сопоставляя наличие человеческого гена (или продукта его экспрессии) с тем, какая из хромосом человека сохранилась в различных гибридных субклонах, можно идентифицировать хромосому, несущую этот ген. С помощью этого метода иммуноглобулиновые гены были локализованы в хромосомах человека 2 (х), 22 (λ) и 14 (IgH). В аналогичных опытах с использованием гибридов между клетками мыши и клетками других грызунов Ig-гены мыши были локализованы в хромосомах 6 (х), 16 (λ) и 12 (IgH).

Три хромосомы, содержащие гены Ig человека, обладают еще одним общим свойством, позволяющим предположить связь между этими генами и раком В-клеток. Со времени открытия хромосомной аномалии при хроническом миело-генном лейкозе (хромосома «Филадельфия») поиск подобных аномалий был предпринят и в случае других злокачественных заболеваний. Было обнаружено, что при лейкозах В-клеток и лимфомах Беркита наблюдаются взаимные транслокации между хромосомой 8 и либо хромосомами 2 и 22, либо, чаще всего, хромосомой 14. Цитологические методы с использованием флуоресцентного красителя акрихина и дифференциального окрашивания хромосом трипсином- Гимзой позволили установить, что участок транслокации хромосомы 14 находится водномиз дисков, обозначаемых как 14q32. Метод картирования генов Н-цепей в хромосоме позволил локализовать их точно в том же участке хромосомы 14. Этот метод основан на гибридизации in situ меченного тритием ДНК-зонда с хромосомой, распластанной на предметном стекле. Стекло покрывают фотографической эмульсией и выдерживают для радиоавтографии. Расположение появляющихся зерен серебра позволяет определить положение данного гена не только в конкретной хромосоме, но и в определенном диске хромосомы. Тот факт, что Кирш и др. выявили гены Н-цепей в диске 14q32 — том же участке хромосомы, который участвует в связанных с раком транслокациях в В-клетках,— позволяет предположить, что транслокации могут происходить внутри локуса генов Н-цепей, и что активная экспрессия этого локуса в В-клетках может быть каким-то образом свйзана с транслокацией и злокачественным перерождением.

Сходные данные позволили связать локус генов человека с хромосомным диском, в котором происходит транслокация 8;2 в некоторых линиях лимфомы Беркита.

Пытаясь точнее картировать участок транслокации 8;14 в линии клеток лимфомы Беркита (Дауди) по отношению к генам Н-цепей, Эриксон и др. получили гибриды клеток Дауди и линии клеток мышиной миеломы. С помощью блоттинга по Саузерну им удалось определить содержание генов VH и СH в различных гибридных субклонах. Было установлено, что субклон, содержавший аномальную хромосому 8, несущую транслоцированный конец плеча хромосомы 14, несет и некоторое число человеческих генов VH, но не содержит С или С. В то же время субклон, несущий аномальную хромосому 14 с транслоцированным участком хромосомы 8, содержал гены С и С человека. Эти данные свидетельствуют о том, что транслокация в линии Дауди происходит внутри локуса генов Н-цепей. Злокачественные клетки мышей, вероятно, должны обладать сходными характеристиками, так как уже известно, что мышиные миеломы содержат частые транслокации дистальной части хромосомы 15 либо на хромосому 6 (несущую гены х), либо на хромосому 12 (несущую гены Н-цепей).

Транслокации происходят в результате межхромосомной рекомбинации. Поскольку рекомбинация — это естественное и необходимое свойство генов Ig, можно задаться вопросом: не способствуют ли транслокациям в локус генов Ig те же их участки, которые необходимы для физиологической рекомбинации, т. е. последовательности ДНК, принимающие участие в рекомбинации V (D) J или в переключении изотипа? Если это так, то можно ожидать, что гомологичные последовательности присутствуют в хромосоме 8 человека (или мышиной хромосоме 15), так как и рекомбинация V (D) Н, и переключение изотипа, по всей видимости, происходят с участием родственных последовательностей обоих рекомбинирующих партнеров. Какие физиологические функции могут выполнять подобные последовательности, находясь вне генов Ig? Для того чтобы углубиться далее в область предположений, необходимо учесть, что иммуноглобулины — это лишь один из многих видов белков, в которых компонент «А» может быть связан с различными компонентами «В» или «С». При этом в зависимости от того, с каким из компонентов («В» или «С») соединится компонент «А», полный белок будет выполнять несколько разных функций, необходимых при различных физиологических условиях, например в разных типа клеток или на разных стадиях развития. Приведем лишь два примера: гемоглобин плода и гемоглобин взрослого содержат одинаковые α-субъединицы, но различаются другой субъединицей — гемоглобин плода содержит γ-субъединицу, гемоглобин взрослого — β-субъединицу; гонадотропины и тиреотропин содержат одну и ту же α-субъединицу, но различаются β-субъединицами. В рассмотренных случаях ассоциируют субъединицы, кодирующиеся разными генами в отличие от перестроек внутри одного полипептида (как в случае Ig). Однако широкая распространенность такого феномена позволяет предполагать, что кроме Ig и другие системы могут использовать рекомбинацию генов для «переключения» компонентов внутри одного полипептида. В связи с этим интересна отметить, что Кирш и др. при изучении мышиной миеломы S107 обнаружили, что последовательности, гомологичные Sμ, существуют вне локуса СH. Миелома S107 продуцирует IgA, и следовало бы ожидать, что в экспрессирующейся хромосоме делетированы все гены СH и сопутствующие им S-области, располагающиеся между генами Sμ и Sa. В неэкспрессирующейся хромосоме миеломы S107 произошла ошибочная рекомбинация непосредственно с 5'- стороны от другой копии гена α, чему, очевидно, сопутствовала делеция оставшихся генов СH, так как блоттинг по Саузерну с использованием μ-, γ- и ε- зондов показывает, что эти гены в миеломе S107 полностью отсутствуют. При гибридизации гаметной ДНК в блоттинге с сегментом S-последовательности, полученным из гена кроме сильной полосы, соответствующей гену Sμ-C, наблюдалось 15 менее выраженнйх полос. Важно то, что почти все эти полосы остаются и в S107 несмотря на то, что эта линия утратила весь локус СH с 5'- стороны от СНа. Объяснить это можно, по-видимому, тем, что слабо выраженные полосы соответствуют последовательностям, родственным S-области, расположенным вне локуса генов Н-цепей и, возможно, принимающим участие в переключении генов каких-либо других систем. Сакояма и др. с помощью подобного же Sμ-зонда проверили ДНК у множества различных видов животных, включая беспозвоночных, не продуцирующих Ig. Тот факт, что перекрестно-гибридизующиеся последовательности были обнаружены у морского ежа, дрозофилы и дрожжей, свидетельствует, очевидно, о том, что у этих организмов может существовать некий механизм переключения генов, не имеющий отношения к генам Ig, и что переключение генов может оказаться эволюционно древним механизмом, перешедшим затем к Ig.

Связь всего вышесказанного с транслокационными событиями часто носит гипотетический характер, так как неизвестно, участвуют ли в этих событиях S-последовательности или сигналы рекомбинации VDJ. В то же время некоторые твердо установленные данные приводят к многообещающим заключениям, касающимся двух других вопросов, связанных с участием транслокаций в злокачественном росте В-клеток: какие последовательности транслоцируются в хромосому 8 и как связана транслокация со злокачественной трансформацией? В мышиной миеломе S107, как упоминалось выше, в неэкспрессирующейся хромосоме произошла ошибочная рекомбинация, при которой новый, не имеющий отношения к генам Ig сегмент ДНК был вставлен с 5'-стороны от гена а. Когда этот «ошибочный» сегмент ДНК (или полученный сходным образом сегмент из миеломы J558) применили в качестве зонда при блоттинге по Саузерну, его удалось отождествить с ВаmН1-фрагментом длиной 5,6 тпн или EcoRI-фрагментом длиной>>22 тпн гаметной ДНК. Харрис и др. и Кирш и др. обнаружили, что большая часть миелом содержит как перестроенную полосу, так и полосу, совпадающую по размеру с гаметной, тогда как в гибридомах перестройки этой последовательности не наблюдалось. То, что эта последовательность перестроена в миеломах, но не в гибридомах, предполагает, что эта перестройка может быть связана со злокачественной трансформацией миелом, а не с экспрессией генов Ig.

Участие специфических генов в злокачественной трансформации было подробно изучено методами рекомбинантных ДНК, и результаты этих исследований явились еще одним триумфом современной генетики. Было обнаружено, что более десятка онкогенных вирусов содержат «онкогены», способные индуцировать злокачественную трансформацию в чувствительных к ним клетках. Вызывает удивление, что каждому вирусному онкогену «v-опс» соответствует близкородственный клеточный ген «с-опс», по-видимому участвующий з нормальных процессах в организме. Считается, что оба гена, как правило, кодируют сходные или идентичные белковые продукты. Таким образом, во многих случаях злокачественная трансформадия связана не с аномальными свойствами вирусного белка, а с повышенным количеством этого белка, индуциро-ванного геном v-onc, который не подчиняется механизмам, регулирующим экспрессию гена с-опс. Фактически ген с-опс может индуцировать трансформацию примерно с той же эффективностью, что и вирусный онкоген, если с помощью методов генетической инженерии с 5'-стороны от его кодирующей последовательности вставить вирусный промотор. Вторым механизмом вирусного онкогенеза может служить включение такого промотора in vivo при интеграции вируса с клеточным геномом вблизи от гена с-опс, что может стимулировать избыточную экспрессию этого клеточного гена. Индукция вирусом злокачественного роста при таком механизме должна протекать с относительно длительным латентным периодом, так как трансформация зависит от редкого события, при котором интеграция происходит случайно вблизи подходящего клеточного гена. Хорошим примером может служить индукция В-клеточных лимфом вирусом лейкоза птиц. Этот вирус трансформирует клетку, интегрируя вблизи клеточного гомолога гена v-onc вируса миелоцитоматоза (v-myc) и значительно стимулируя образование вирусоспецифической РНК. Учитывая специфичность этого вируса для трансформации В-клеток, Тауб и др. изучили возможность того, что описанный выше «ошибочный» сегмент ДНК (который, по-видимому, специфически перестраивается в миеломах) может иметь отношение к гену mуc. Оказалось, что этот сегмент ДНК хорошо гибридизуется с клонированным геном с-mус курицы. Это позволяет утверждать, что новая последовательность, появляющаяся с 5'-стороны от неэкспрессирующегося гена ос в миеломе S107, и есть с-mус. Когда в качестве зонда при блоттинге по Саузерну ДНК из 10 линий клеток Беркита был использован ген с-mус человека, во всех линиях был обнаружен фрагмент EcoRI длиной 12,5 тпн, содержащий неперестроенный ген с-mус человека, а в 5 линиях наблюдалась дополнительная полоса перестроенного гена с-mус. В двух из этих линий полоса перестроенного гена с-mус комигрировала с полосой, идентифицированной при помощи человеческого μ-зонда с использованием двух рестриктаз; это позволяет предположить, что в этих клетках ген с-mус перестроен в область, близкую к человеческому гену μ. Наконец, с помощью гибридизации in situ было показано, что ген с-mус человека располагается в диске q24 хромосомы 8, т. е. в том же участке ДНК, который принимает участие в транслокациях в хромосомы 14, 22 и 2, содержащие гены Ig. Из этих данных вытекает интересное предположение: злокачественный рост В-клеток может быть следствием активации гена с-mус, возникающей не с помощью вирусного промотора, а в результате транслокации этого гена в участок, близкий к активно экспрессирующимся генам Ig. Те же локальные особенности хромосомы, которые активируют гены /^В-клеток, могут активировать и сближенный с ними в результате транслокации ген с-тус, что и приводит к злокачественной трансформации. Эта гипотеза имеет большое значение, так как предполагает причинную связь между наблюдающимися при раке хромосомными транслокациями и генами с-опс, которые могут быть ответственны за злокачественное перерождение. То, что перестроенный ген с-mус был обнаружен не во всех миеломах или лимфомах Беркита, может означать, что это — не единственное объяснение трансформации В-клеток. Этот факт, однако, может объясняться и просто тем, что рекомбинация в этом случае произошла за пределами участков, вырезаемых использованными для блоттинга по Саузерну рестриктазами, и не была обнаружена. Кроме важнейшего значения этих результатов для онкологии они позволяют объяснить также один из видов перестроек в генах Ig, наблюдающихся при блоттинге по Саузерну миеломной ДНК.