Главная



Иммунология и вакцинация

Переключение тяжелой цепи

Сразу после выделения первых геномных клонов СH была предпринята попытка выяснить механизм переключения Н- цепей. Был проведен сравнительный анализ активных «переключенных» генов из нескольких миелом с соответствующими гаметными генами СH и с гаметным геном μ. Особое внимание уделялось последовательностям, расположенным по обе стороны от участка, в котором осуществляется рекомбинация при переключении. Во всех случаях оказалось, что рекомбинационные события происходят в пределах участков, содержащих последовательности ДНК с внутренними повторами и расположенных с 5'-стороны от последовательностей, кодирующих СH; эти участки были названы областями переключения (S-области — от англ. switch).

S-область гена μ, Sμ, расположена на расстоянии около 1—2 тпн со стороны 5'-конца от кодирующей последовательности и состоит из множественных тандемных повторов типа (GAGCT) (GGGGT), где n обычно равно 2—5, но может достигать и 17. Наличие таких повторов, по-видимому, способствует делециям в области Sμ при гомологичных рекомбинациях, которые могут происходить в процессе экспериментального конструирования и выделения клонов, содержащих Sμ-область. Благодаря таким делециям, большинство клонированных гаметных μ-генов обнаруживается в EcoRI-фрагментах, длина которых была меньше 12,5 тпн, т. е. длины фрагментов, выявляемых при блоттинге по Саузерну геномной ДНК мышей линии BALB/c. При сравнении локусов μ у мышей различных линий было показано, что подобные делеции могут происходить и in vivo.

Сходные S-последовательности с внутренними повторами, охватывающие области в несколько тысяч пар оснований, обнаружены с 5'-стороны и других генов СH. В опытах с использованием блоттинга по Саузерну было показано, что зонд Sμ гибридизуется сильнее всего с Se, несколько слабее с α, слабо с Sγs и совсем не гибридизуется с другими областями Sγ. Анализ первичной структуры показал, что область Sα состоит из тандемно повторяющихся гомологичных элементов длиной 80 пн, тогда как Sγ1, Sγ2 и Sγ3 содержат сходные между собой повторяющиеся гомологичные элементы длиной 49 пн. Во всех S-областях с известной последовательностью очень часто встречаются пентамеры GAGCT и GGGGT, которые являются основным повторяющимся элементом гена Sμ; в других S-областях эти пентамеры не образуют тандемных повторов, а входят в состав более крупных повторяющихся единиц. На основе высокой частоты делеций в S-области, обусловленной, по-видимому, гомологичными рекомбинациями между внутренними повторами, было высказано предположение, что гомология между повторяющимися элементами различных S-областей может способствовать рекомбинации между этими областями, лежащей в основе переключения изотипа.

Путем сравнения последовательностей гаметной области Sμ с гаметной Sα и Sα в рекомбинировавших миеломных генах удалось точно локализовать место рекомбинации μ и α в нескольких а-продуцирующих миеломах; аналогичный анализ был проведен и для γ-продуцирующих миелом. Результаты этих опытов показали, что как в так и во всех других S-областях нет такой специфической точки, в которой рекомбинация проходит во всех случаях. Таким образом, в отличие от ферментного аппарата рекомбинации V-J система переключения тяжелых цепей, по-видимому, может осуществлять рекомбинацию в различных участках, содержащих гомологичные повторы гаметных S-предшественников и затем соединять эти последовательности в разных точках в пределах данной области. Было замечено, что последовательность YAGGTTA (где Y = С или Т) часто располагается вблизи от места рекомбинации при переключении и, видимо, может играть какую-то роль при выборе места рекомбинации. Тот факт, что структуры S-областей у разных изотипов неидентичны, позволил высказать предположение, что индивидуальные S-области могут узнаваться различными ферментными системами. Это позволило бы регулировать появление определенного изотипа, влияя на активность изотип- специфических ферментов, участвующих в переключении, возможно, с помощью Т-хелперных факторов. Тот же механизм мог бы отвечать и за специфические к изотипу ответы на разные антигены и способы иммунизации.

Было показано, что S-области генов Н-цепей человека очень похожи на томологичные гены мышей. Действительно, гомология между участками клонов человека и мыши, прилегающими к генам СH на 5'-концах, распространяется и на 5-области, что также подтверждает биологическое значение этих районов.

Структура как гаметных предшественников, так и «переключенных» генов Н-цепей изучена довольно подробно, однако сам процесс переключения остается малопонятным. Несмотря на наличие данных в пользу делеции СH-областей, располагающихся с 5'-стороны от экспрессируемого гена СH в работающей хромосоме, до сих пор неясно, происходит ли рекомбинация с помощью простого механизма делеции с вырезанием петли или же путем обмена между сестринскими хроматидами. Против простой модели с вырезанием петли свидетельствуют два наблюдения. Во-первых, это описанная в работе Обата и др. структура «переключенного» гена γ1. В этом гене между Sμ и Sn встроен сегмент Sa длиной 0,5 тпн. Такой сегмент можно было бы считать остатком происшедшей ранее рекомбинации между Sμ и α, но, согласно делеционной модели, такое переключение должно было бы привести к делеции генов СH, расположенных с 5'-стороны от а и сделать невозможным второе переключение с участием γ1. Во-вторых, при переключении изотипа линии В-клеток иногда наблюдается «обратное» переключение («реверсия»), т. е. переключение на изотип, который, согласно делеционной модели, должен бы быть делетирован из экслрессируемой хромосомы. Оба этих наблюдения можно объяснить с помощью модели обмена между сестринскими хроматидами следующим образом: при первом акте переключения образуется продукт реципрокной рекомбинации, содержащий фланкирующие последовательности, в котором гены СH, располагавшиеся в гаметной ДНК с 5'-стороны от, например, гена ос, окажутся дуплицированными с 3'-стороны от него. Такой сегмент ДНК, перешедший в до-чернюю клетку после первого акта переключения, может подвергнуться вторичному переключению между Sμ и Sa, а затем и третьему (кажущемуся «обратным») переключению с участием одного из генов у, дуплицированного с 3'-стороны от гена а. «Обратное» переключение можно объяснить также на основе рекомбинации между рекомбинировавшим сегментом Sμ — Sa одной хромосомы и сегментом Sγ гомологичной хромосомы. Впрочем, на основании генетических данных по скрещиванию родительских линий, гомозиготных по специфическим аллотипическим маркерам V и С, и определению в поколении Fx образования антител, несущих маркеры обеих родительских хромосом, считается, что межхромосомная рекомбинация встречается редко. С другой стороны, возможно, что «обратное» переключение при нормальном развитии В-клеток как физиологическое событие случается также очень редко либо вообще не происходит. Действительно, на основании результатов блоттинга по Саузерну ДНК клеток с «обратными» перестройками было высказано предположение, что механизм перестроек in vitro отличается от механизма переключения изотипа в физиологических условиях. Из сказанного ясно, что изучение деталей механизма переключения изотипа представляет широкий простор для дальнейших исследований.