Главная



Иммунология и вакцинация

Гены легких цепей лямбда

Гены, кодирующие L-цепи λ, подробно исследованы у человека и мыши. У лабораторных линий мышей λ-цепи составляют лишь около 5 % от всех L-цепей, причем их пониженное содержание сопряжено с заметно сниженным разнообразием. В противоположность системе к с ее многочисленным семейством генов V в системе генов Я мыши содержатся только два гаметных гена F. Кроме того, в отличие от единственной СX-области, при изучении аминокислотных последовательностей С-области секретируемых цепей λ у мыши было обнаружено три неаллельных изотипа λ. Они известны как λ1, λ2 и λЗ (в порядке уменьшения содержания)

Первым проклонированным геном λ был полученный в лаборатории Тонегавы (Tonegawa) в 1977 г. гаметный ген V. (В действительности это был первый проклонированный ген Ig.) Общую эмбриональную ДНК расщепляли EcoRI и нужный фрагмент очищали препаративным электрофорезом в агарозе с последующей препаративной гибридизацией его с очищенной мРНК и центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Очищенный в 350 раз фрагмент ДНК при помощи лигазы присоединяли к «плечам» бактериофага. Эту ДНК использовали для трансфекции Е. coli. Из полученных в результате 4000 бляшек при помощи гибридизации с λ-мРНК миеломы был выделен клон Vλ.

Изучение последовательности Vλ показало, что структура этого гена напоминает структуру гаметного гена VX, описанного в предыдущем разделе (хотя ген х был выделен позднее). Последовательность, кодирующая состоящий из 19 остатков сигнальный пептид, прерывалась внутри кодона —4 интроном из 93 нуклеотидов (фактически это был один из первых обнаруженных интронов). После остальных кодонов сигнального пептида последовательность продолжалась без перерывов. Соответствующая последовательность аминокислот была близка к последовательности гена Vλ2. (Пять отличий последовательности этого гена от последовательности аминокислот Vλ2-цепей из МОРС315 была отнесена на счет соматических мутаций в этой миеломе.) Ген внезапно оканчивался на расстоянии 13 кодонов от ожидаемого конца F-области, что и привело впервые к предположению о существовании отдельной J-области. Впоследствии группа Тонегавы получила из миеломы перестроенный клон F — С для λ1, а также гаметные клоны V и С для λ1 из эмбриональной ДНК. Используя эти клоны, авторы с помощью блоттинга по Саузерну и анализа нуклеотидных последовательностей продемонстрировали перемещение гена V миеломы в участок, расположенный на расстоянии примерно в 1,3 тпн от 5'-кон- ца гена С, т. е. в область гена J.

Дальнейшие исследования значительно расширили наши знания о локусе X у мыши. В нем существует четыре гена С1, каждый со своим геном J, расположенным на расстоянии примерно 1,3 тпн в 5'-сторону от гена С. На 5'-концах всех генов J имеются последовательности, гомологичные гептамеру и нонамеру, обнаруженным в системе х. В системе λ, однако, эти элементы разделены приблизительно лишь 12 нуклеотидами в отличие от 22 в генах х. Гены JCλ3 и JCλ1 сгруппированы в кластер и отделены друг от друга примерно 3 тпн. Другой кластер содержит JCλ2 и неэкспрессируемый ген Jλ4. Гомология между четырьмя генами С позволяет предполагать, что эти два кластера появились в результате дупликации предшествующего блока JCλx—JCλy, который в свою очередь возник в результате более раннего акта дупликации. Последовательности эти были проанализированы также и с целью обнаружения особенностей, объясняющих относительное количество продуктов их экспрессии — λ1 > λ2 ≈ λ3 >>> λ4. Последовательность детерминирует несколько аминокислотных замен, но не содержит терминирующих кодонов, способных превратить этот ген в нефункционирующий. На З'-конце гена />,4, однако, мутация разрушила участок «GT...», присутствующий во всех «донорных» участках сплайсинга, так что РНК, транскрибированная с этого гена, не способна правильно созревать (наподобие гена хJ5 мыши). Уменьшенное количество λ2 и λ3 в сравнении с М может объясняться несоответствием их нонамерных гомологичных элементов последовательности «идеального» нонамера.

В лаборатории Тонегавы были получены клоны и определены последовательности двух гаметных генов λF-области. как упоминалось выше, связан с Fu связан с Сλ1 и Сλ3. Блоттинг по Саузерну гаметной ДНК с использованием зондов Fu и FX2 не выявил дополнительных гомологичных полос и, таким образом, позволил сделать вывод, что две клонированные F-области — это все содержащиеся в гаметном геноме мышей BALB/c гены А,F-областей. Точное взаимное расположение двух генов F и двух дуплицированных элементов J С — J С неизвестно, так же как неизвестна локализация этих четырех сегментов в хромосоме.

Распространенная гипотеза, согласующаяся со всеми имеющимися сейчас данными, указывает порядок расположения [5'- Vλ1JCλ1-3'] и [5'- Vλ2 — JC2 — JC4-З']. Относительное расположение заключенных в скобки сегментов неизвестно.

Оба гаметных гена Vλ мыши содержат консервативные элементы (гептамер и нонамер), найденные и в генах Fx, хотя в генах X расстояние между ними (спейсер) составляет 23 нуклеотида в отличие от 12 нуклеотидов в генах Fx. Промежутки между этими элементами в гаметных генах (23 нуклеотида) и J (13 нуклеотидов), таким образом, противоположны промежуткам в системе х. Эти наблюдения привели к гипотезе, согласно которой для осуществления рекомбинации F— J необходимо сочетание спейсеров двух типов. Это предположение подтвердилось при изучении рекомбинации в Н-цепях, но с одним интересным дополнением, о чем будет сказано в следующем разделе.

У человека L-цепи λ встречаются значительно чаще, чем у мыши (около 40% против 5% у мыши). Кроме того, у человека обнаружены четыре неаллельные формы L-цепей λ, обозначенные обычно их первоначальными серологическими символами: Kern-Oz-, Kern-Oz+, Kern+Oz- и Meg. Были обнаружены и некоторые другие варианты, однако тот факт, что они представляют собой добавочные неаллельные формы, а не результат аллельного полиморфизма, не был точно установлен. Исходя из различий между системами λ человека и мыши, можно было ожидать, что гены λ человека устроены сложнее. Действительно, Хитер и др. описали фрагмент ДНК человека длиной 50 тпн, содержащий шесть последовательностей λ С-области и, кроме того, еще три сегмента со слабой гомологией. Для выделения человеческих клонов был использован межвидовой гибридизационный зонд — клон мышиной кДНК АД. Была определена последовательность трех из шести сцепленных генов, которые были идентифицированы как гены Kern-Oz-, Kern-Oz+ и Meg. Ген КегпЮгпо всей видимости, находится среди оставшихся трех генов кластера; другие два гомологичные гена представляют собой либо добавочные варианты, либо неэкспрессируемые псевдогены. Один из слабогибридизующихся клонов, не входящий в кластер, был четко идентифицирован как псевдоген, принадлежащий к интересному классу «процессированных» генов. Псевдогены этого типа, по всей видимости, произошли путем обратной транскрипции с процессированной РНК и включения образованной ДНК в участки генома, не связанные с локусами исходных генов.