Главная



Иммунология и вакцинация

Получения антисыворотки к белковым антигенам

Иммунизация кроликов белковыми антигенами
Иммунизация карпов белковыми антигенами
Метод эффективной иммунизации кроликов небольшими количествами антигена
Получение моноспецифических сывороток при отсутствии полностью очищенного антигена
 

Ранее было отмечено, что оптимальный способ иммунизации зависит от природы антигена, вида подопытного животного и цели, которой будет служить антисыворотка. В качестве примера можно привести получение антисывороток путем иммунизации кроликов и карпов белковыми антигенами в нашей лаборатории. Этот метод применим и к другим моделям. Далее описывается способ иммунизации, основанный на применении очень малых количеств антигена. В заключение рассматривается вопрос о возможности получения моноспецифических сывороток.

Иммунизация кроликов белковыми антигенами

Материалы и оборудование: для получения одного антигена необходимо
3 кролика любой породы, желательно с большими ушами для удобства отбора крови из ушных вен;
0,14—14 мг антигена на кролика;
ПАФ;
шприц для инъекций (2 мл) с иглой № 16,
раствор NaCl (9 г/л), в тех случаях, когда концентрация NaCl не указана, речь идет об изотоническом растворе натрия хлорида.

Проведение иммунизации: первую иммунизацию проводят с полный адъювант Фрейнда Каждому кролику вводят смесь 0,5 мл антигена (20— 2000 мкг) с 0,5 мл полный адъювант Фрейнда Для получения стабильной эмульсии смесь многократно набирают в шприц и с силой выпускают через тонкую иглу. О качестве препарата судят по тому, что капли эмульсии при попадании в воду не распадаются в течение получаса и более. Смесь антиген-ПАФ в количестве 1 мл вводят внутрикожно в подушечки стоп всех четырех конечностей. Последующую иммунизацию проводят через 8 недель после первой, таким же количеством антигена в 0,5 мл 0,15 М NaCl. В первый день последующей иммунизации антиген вводят внутримышечно в верхнюю часть бедра, а на 2-й и 3-й дни внутривенно в ухо. Через неделю иммунизацию повторяют по той же схеме. Забор крови производят через 7—10 дней после последней иммунизации.

Иммунизация карпов белковыми антигенами

Материалы и оборудование: для получения одного антигена необходимы
5 карпов с массой тела 500—1500 г. Рыб адаптируют к температуре воды 24 °С в течение 2 недель и содержат при этой температуре весь период иммунизации. Как правило, карпы продуцируют летом больше антител, чем зимой. Необходимо иметь 1—2 мг антигена на каждую особь, ПАФ, неполный адъювант Фрейнда (НАФ), шприц (2 мл) с иглой № 16, раствор NaCl (60 г/л).

Проведение иммунизации: первичную иммунизацию проводят с полный адъювант Фрейнда Раствор антигена в количестве 0,25 мл (100— 1000 мкг) тщательно смешивают с полный адъювант Фрейнда и вводят получившуюся эмульсию внутрибрюшинно. Повторную иммунизацию проводят через 2 месяца. Затем 0,25 мл раствора антигена (1000—2000 мкг) смешивают с 0,25 мл неполный адъювант Фрейнда и вводят внутрибрюшинно. Через 2 недели забирают кровь из сердца и анализируют сыворотку. Если количество антител недостаточно, то через 4 недели проводят третью иммунизацию с 0,5 мл раствора антигена без адъюванта. Забор крови производят через 2 недели после последней иммунизации.

Метод эффективной иммунизации кроликов небольшими количествами антигена

В основу этого метода положена индукция локальной иммунной реакции лимфатических узлов малой дозой антигена. Образующиеся клетки памяти распределяются по всему организму, последующее введение соответствующего антигена стимулирует популяцию сенсибилизированных лимфоцитов, начинающих интенсивно синтезировать антитела. Готовят эмульсию антигена и полный адъювант Фрейнда Содержание антигена должно быть не менее 10 мкг/мл. Каждому кролику вводят около 1 мл эмульсии. Большим и указательным пальцами находят подколенный лимфатический узел задней ноги. Для этого необходим определенный навык, приобретаемый при работе с животным, которому за неделю до этого вводили полный адъювант Фрейнда под кожу верхней части бедра.

Эта инъекция приводит к увеличению лимфатических узлов, которые становятся доступными для пальпации. Однако эти животные вследствие структурных изменений лимфатических узлов по меньшей мере в течение 2 месяцев непригодны для иммунизации.

Животных, ранее бывших в опыте, не следует иммунизировать. После того как лимфатический узел найден, его фиксируют кончиками пальцев. В лимфатический узел тонкой иглой вводят 0,3 мл эмульсии. При попадании материала в лимфатический узел последний вздувается под пальцами экспериментатора. Наш опыт показывает, что даже при инъецировании окружающих лимфатический узел тканей наблюдается выраженный иммунный ответ. Точно также антиген вводят в симметричный лимфатический узел. Оставшиеся 0,4 мл смеси вводят равными частями подкожно в подушечки стоп задних конечностей. Не ранее чем через 6, а лучше через 8 недель проводят повторную иммунизацию. Для этого антиген вводят с неполный адъювант Фрейнда или в растворе NaCl. Каждому кролику вводят не менее 10 мкг материала; по 0,1—0.2 мл смеси вводят подкожно в каждую конечность. Подкожные инъекции повторяют с недельным интервалом до достижения достаточного титра антител.

Получение моноспецифических сывороток при отсутствии полностью очищенного антигена

Во многих случаях очень сложно или даже невозможно получить нужный антиген в чистом виде. Существует несколько способов получения моноспецифических сывороток без полной очистки антигена.

Иммунизация белками, разделенными в полиакриламидном геле: при помощи диск-электрофореза, изоэлектрофокусирования можно получить отдельные фракции антигена, свободные от примесей. Поскольку полиакриламид обладает свойствами адъюванта, можно проводить иммунизацию непосредственно кусочками полиакриламида, содержащими соответствующий компонент. Достаточно взять 1 мкг белка. В остальном иммунизацию проводят так же, как в случаях с небольшими количествами антигена.

Иммунизация антигеном из зоны преципитации при иммуноэлектрофорезе: этот метод существенно отличается от обычных способов очистки антигена. Подопытное животное, например кролика, иммунизируют неочищенным препаратом антигена. После получения сыворотки с высоким титром АТ (антитело) проводят иммуноэлектрофорез в микромодификации на предметном стекле. Затем идентифицируют линию преципитации соответствующего антигена, для чего используют селективное окрашивание, ферментативные реакции или сравнение со стандартным антигеном. После идентификации иммуноэлектрофорез проводят параллельно на большом количестве стекол. Линию преципитации антигена тщательно вырезают, избегая мест перекрещивания с другими линиями преципитации. Вырезанные фрагменты отмывают в течение 2 дней в растворе NaCl с многократной сменой раствора, затем в течение 1 дня дистиллированной водой с добавлением цитостатиков, например мертиолята. После отмывки фрагменты геля подвергают механическому измельчению (скальпелем и ножницами) и суспендируют в 1 мл раствора NaCl. Суспензию эмульгируют с полный адъювант Фрейнда Эмульсию вводят кролику в лимфатические узлы и подушечки стоп. В отличие от других схем иммунизации повторную иммунизацию проводят через 6 нед с использованием ПАФ, а не неполный адъювант Фрейнда. Эмульсию преципитат-адъювант в количестве 0,4 мл медленно вводят в вены уха, остальное количество вводят подкожно в конечности. Через 7 дней определяют титр сыворотки иммунизированных животных в иммуноэлектрофорезе. При низких титрах проводят повторную иммунизацию отмытым преципитатом без адъюванта подкожно. Повторные иммунизации проводят с недельным интервалом. Если же антисыворотка не обладает моноспецифичностью, прибегают к иммунизации других животных преципитатами, полученными при помощи олигоспецифической сыворотки. До настоящего времени нам всегда удавалось получить моноспецифическую сыворотку от одного или двух животных, задействованных в эксперименте.

Иммуноэлектрофорез с применением антисыворотки к бычьему γ-глобулину

Иммуноэлектрофорез с применением антисыворотки к бычьему глобулину
В качестве антигена использовали грубоочищенную фракцию глобулинов (вверху) и сыворотку крупного рогатого скота (внизу).

Получение моноспецифической сыворотки путем адсорбции: олигоспецифическую сыворотку можно сделать моноспецифической, удалив антитела с нежелательной специфичностью с помощью адекватных сорбентов. Как правило, для этого используют нерастворимые иммуносорбенты, получаемые при соединении антигена с инертным носителем, например, при помощи глютарового альдегида.