Главная



Иммунология и вакцинация

Пассивный метод локального гемолиза

Основную сложность пассивного метода локального гемолиза представляет собой непосредственный контакт индикаторных эритроцитов с антигеном в одном слое, причем эритроциты не должны самопроизвольно разрушаться и в то же время должны быть доступны для антител и комплемента. Принципиально известны два способа присоединения антигена к эритроцитам — химический и иммунологический. Описаны многочисленные варианты этих методов. Мы приводим выборочно некоторые из них с учетом применяемых антигенов и способов их конъюгирования с эритроцитами.

Получение индикаторных эритроцитов

Белки: известны три метода химической конъюгации. Прежде всего это метод с применением ЭКДИ [1-этил-1,3 (3-диметил-аминопропил) карбодимида-HCl]. К 3 мл раствора белка (10— 80 мг/мл в зависимости от используемого белка) добавляют 0,1 мл 50% СЭБ (лучше использовать эритроциты козы), затем 0,5 мл раствора ЭКДИ (100 мг/мл). В качестве растворителя для всех компонентов применяют фосфатно-солевой буфер (ФСБ). После одночасовой инкубации при 2°С в покое эритроциты отмывают ФСБ с 1 % сывороткой. При помощи ЭКДИ получают сохраняющие стабильность в течение нескольких месяцев эритроциты-мишени, особенно если к нативным или тиогликолированным эритроцитам присоединяют сукцинил- или 3-(2-пиридилтио)пропионил- производные белков.

Самый простой метод конъюгирования белков с эритроцитами основан на использовании хлорида хрома. Процесс идет при следующих оптимальных условиях: 1 объем 50% суспензии эритроцитов барана смешивают с 1 объемом 0,5 мМ хлорида хрома и 1/10 объема 2% БСА, тщательно перемешивают. Исходный 1% водный раствор хлористого хрома хранится в темной посуде при 4°С в течение нескольких недель. Все компоненты смеси приготовляют на 0,15 М NaCl. Рекомендуется соблюдать последовательность операций. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 37 °С, перемешивая ее несколько раз. Эритроциты трижды отмывают ФСБ (фосфат ингибирует реакцию). Описаны и другие условия постановки реакции. Для постановки реакции локального гемолиза возможно использование эритроцитов барана, конъюгированных с сывороточными белками при помощи бисдиазотированного бензидина (БДБ). Белок в количестве 10—15 мг растворяют в 18 мл ФСБ, приливают к 0,5 мл 50% суспензии эритроцитов барана, тщательно перемешивают на водяной бане со льдом. БДБ, который хранится при —70 °С, размораживают, берут 0,2 мл и немедленно смешивают с 2,8 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Полученную смесь (3 мл) немедленно приливают к охлажденной до 0°С СЭБ. Конъюгация происходит при 0°С в течение 30 мин при постоянном помешивании. Объем смеси доводят ФСБ до 50 мл. Отмывают эритроциты ФСБ. Приготовленные таким образом индикаторные эритроциты сохраняются при 4 °С в течение нескольких часов.

Методы иммунологической конъюгации основаны на прямом или непрямом связывании белков с антителами к эритроцитам барана. АОК к гетерологическим иммуноглобулинам, бычьему и человеческому (БГГ, ЧГГ) обнаруживаются сравнительно просто. Эритроциты барана сенсибилизируют субгемолитическими количествами анти-ЭБ-антител. АОК против БГГ обнаруживают при помощи эритроцитов барана, инкубированных с разведенной сывороткой против ЭБ крупного рогатого скота. Смешивают равные объемы 2,5% суспензии ЭБ и разведенной в соотношении 1:200 сывороткой против ЭБ (титр гемолизинов неразведенной сыворотки равен 1: 160, все компоненты растворяют в 0,15 М NaCl), инкубируют 1 ч при 37 °С, смесь несколько раз перемешивают. После отмывки эритроциты готовы к употреблению. Вместо валовых иммуноглобулинов можно использовать моновалентные Fab-фрагменты антител к эритроцитам или IgG кур (IgG птиц не связывает комплемент млекопитающих) в высоких концентрациях, что исключает связывание комплемента с сенсибилизированными эритроцитами. Оба эти способа можно с успехом использовать для конъюгирования различных гаптенов. Связывание белков с антителами или их фрагментами глютаровым альдегидом трудноосуществимо, применительно к локальному гемолизу оно себя не оправдало. Индикаторные клетки после конъюгации иммунологическим методом можно хранить в холодильнике в течение многих дней.

Бактериальные полисахариды. Конститутивные полисахариды, например эндотоксины грамотрицательных бактерий или капсульные углеводы пневмококка, могут быть адсорбированы на эритроцитах. В зависимости от метода их получения они содержат различную долю фосфолипидов и белков.

Эндотоксин. Для конъюгации эндотоксинов с ЭБ предложено большое количество сходных способов. Мы рекомендуем следующий метод: липополисахарид сальмонелл (коммерческий препарат или препарат по Вестфалю) перед употреблением разводят до 0,1% концентрации в 0,15 NaCl, затем кипятят в течение 1 ч, охлаждают и прибавляют к 2—10 мл смеси 1 мл осадка ЭБ. Инкубируют 30 мин при 30 °С, затем трижды отмывают эритроциты. Особое внимание при выборе липополисахарид и эритроцитов следует обращать на перекрестные реакции антигенов эритроцитов с липополисахарид бактерий.

Капсульные антигены пневмококка. Строение этих антигенов точно установлено, например, антиген пневмококка III типа представляет собой полимер 3-β-О-гликозил-4-β-О-глюкуроновой кислоты. Собирают надосадочную фракцию 8—12 часовых культур, рН которых доводили до 7,0 добавлением бикарбоната натрия. К 10 мл 1% суспензии ЭБ добавляют 0,9 мл фильтрата надосадочной фракции и инкубируют 45 мин при 37 °С. После инкубации эритроциты трижды отмывают. Оптимальный объем фильтрата для сенсибилизации ЭБ определяют эмпирически. Если сорбции подлежат нейтральные или безлипидные полисахариды, например декстран, то для оптимизации сорбции используют липоиды, например стеариновую кислоту. Процесс сенсибилизации очень прост: к 1 мл 1% СЭБ добавляют 20 мкг О-стеарин-декстрана (1% остатков стеариновой кислоты) в объеме 20 или 50 мкл, перемешивают, смесь инкубируют 30 мин при 37 °С. Трижды отмывают ФСБ.

Гаптены. К эритроцитам можно присоединять значительное количество гаптенов, применяемых для обнаружения антителообразующих клеток. Антигенные детерминанты можно фиксировать на мембране эритроцитов непосредственно или с помощью конъюгатов белок— гаптен. При последнем способе меньше повреждаются мембраны эритроцитов, чем при прямом химическом присоединении гаптена. Мы приводим в качестве примера три различных способа прямого конъюгирования.

Нитрофенилирование. К эритроцитам могут быть присоединены самые различные нитрофенильные производные. Наиболее часто применяемые ДНФ- и ТНФ-гаптены присоединяют при помощи водорастворимых реагентов, таких как бензолсульфонат и динитрофторбензол.

Сульфоновокислотный метод. 20 мг 2,4,6-тринит-робензолсульфоновой кислоты (ТНБК) растворяют в 7 мл 0,26 М какодилатного буфера с рН 6,9. Добавляют 1 мл осевших ЭБ, суспензию перемешивают 10 мин при 23—25 °С. Нагруженные эритроциты отмывают в холодном ФСБ до тех пор, пока надосадочная фракция не станет бесцветной. Все процедуры, в том числе и связывание гаптена, проводят в темноте для предотвращения его фотоиндуцированного отщепления.

Ацилазидный метод. Для присоединения к эритроцитам 4-гидрокси-3,5-динитрофенилацетазид (NNP)- и З-йод-4-гидрокси-5-нитрофенилацетазид (NIP)-групп используют ацилазидные производные, образующие амидные связи с аминогруппами мембран эритроцитов. Конъюгация NNP-азида с ЭБ проходит в 0,12 М карбонатбикарбонатном буфере с рН 9,25. Суспензию отмытых ЭБ (1%) смешивают с NNP-азидом в концентрации 0,001—1 мг/мл. После 16-часовой инкубации при 4°С конъюгированные эритроциты отмывают 3 раза.

Диазотирование. Диазотирование относится к простейшим способам конъюгации. Для проведения реакции смешивают равные объемы 0,002—0,005 М диазореактива и 50% СЭБ, доводят рН до 7,4—7,8, инкубируют 1—2 ч при 20 °С или оставляют на ночь при 4°С. Для повышения стабильности конъюгированных эритроцитов небольшой избыток диазореактива нейтрализуют прибавлением ароматического амина, избыток нитрита нейтрализуют 0,1 М мочевиной.

После диазотирования ЭБ отмывают в растворе альбумина или сыворотки с целью удаления не связанных ковалентно продуктов реакции. При помощи этого метода можно обнаруживать антителообразующих клеток, продуцирующие иммуноглобулин против азобензоларсоната, азобензолсульфоната и азобензилгалактозида.

Пенициллиновая конъюгация. Бензилпенициллина калиевая соль (БПК) присоединяется к ЭБ в изотоническом триметиламиновом буфере с рН 10 или в 0,14 М глициновом буфере с рН 10. Растворяют 600 мг БПК (1,6 мМоль или 106 ME) в 20 мл буфера и прибавляют 1 мл осадка эритроцитов. Смесь инкубируют при 25 °С в течение 50 минут, клетки отмывают 4 раза. При описанных условиях бензилпенициллоильные группы ковалентно связываются через амидные группы с мембраной эритроцитов.