Главная



Иммунология и вакцинация

Аффинность

Под аффинностью понимают силу связывания активного центра молекулы антитела с соответствующей детерминантой антигена. Для точного измерения аффинности необходимо, во-первых, ограничить гетерогенность исследуемых антител и, во-вторых, не допускать образования нерастворимых комплексов, т. е. исследовать обратимую реакцию. Первое требование может быть достигнуто использованием для иммунизации конъюгатов гаптенноситель. В этом случае гаптен выступает в роли доминантной иммуподетерминанты известного химического строения и антитела образуются преимущественно к гаптену.

Пока нет способа предотвратить образование гетерогенных антител к гаптену. Для реакции антиген-антитело используют только моновалентные гаптены. что позволяет избегать образования нерастворимых комплексов. Антитела к носителю не влияют на результаты измерений. Обратимая реакция связывания антидетерминанты АТ (антитело) с моновалентным гаптеном (Г—) приводит в соответствии с законом действия масс к образованию растворимого комплекса антитело — гаптен

Аффинность в данном случае можно выразить константой ассоциации Ка:

или при использовании других символов:

где Ка — константа ассоциации, b — концентрация связанного с АТ (антитело) гаптена (в молях), с — концентрация свободного гаптена (в молях), N — концентрация антидетерминант антител (в молях).

Константа ассоциации равна обратной величине значения концентрации свободного гаптена (с) при условии, что половина антидетерминант связана с гаптеном (Ь), а другая половина не связана (N—b), т. е. N—b = b. Важнейшим условием оценки аффинности является определение концентрации антидетерминант (N).

В простейшем случае для этого пользуются специфически очищенными антителами; возможно также определение антидетерминант самостоятельными методами, например РИА, и количественным осаждением (преципитацией). Можно определять концентрацию антидетерминант при помощи методов оценки аффинности в условиях очень высоких концентраций гаптенов. В таких условиях вероятность насыщения участков связывания антител довольно высока и, зная b, можно вычислить N. Основная проблема определения аффинности заключается в определении первых значений b и с в возможно более обширной области значений степени насыщения антидетерминант гаптеном. Для этой цели было предложено много методов: равновесный диализ, модифицированный метод осаждения сульфатом аммония, гашение флюоресценции, усиление флюоресценции, торможение преципитации гаптеном. В настоящей главе мы ограничимся описанием первых трех методов. Реакции антиген-антитело могут быть изучены и другими методами, например путем измерения степени поляризации флюоресценции. Последний метод пригоден также для исследования кинетики реакций и равновесных состояний.