Главная



Иммунология и вакцинация

Мечение 3[H] и 14[C]

К числу недостатков йодной метки относится сравнительно короткая продолжительность жизни изотопов йодов. Тритий и радиоактивный углерод выгодно отличаются в этом отношении. Сравнительно высокая энергия распада этих радиоактивных элементов делает их использование в иммунобиологических исследованиях весьма перспективным.

Мечение методом восстановительного метилирования

Аминогруппы белка могут быть восстановлены до моно- или диметиламиногрупп. Метку в метальную группу можно вводить посредством меченого I4[C] формальдегида или меченого тритием боргидрида натрия. Эффективность реакции существенно зависит от рН.

Состав смеси: к 0,1 мг белка в 0,1 мл 0,2 М натрий-боратного буфера с рН 9 добавляют 10 мкл 14[С]-формальдегида (0,04 моль/л). Через 30 с в смесь вносят четырехкратное количество боргидрида натрия в объеме 2 мкл (0,15 моль/л). Еще через 60 с к смеси добавляют 10 мкл раствора боргидрида натрия. Непрореагировавшие низкомолекулярные компоненты удаляют диализом. Обычно получаются препараты с невысокой специфической активностью. Специфическую активность можно повысить, используя меченный тритием боргидрид натрия. К 0,5 мл белка (5 мг/мл) в 0,2 М боратном буфере с рН 9 добавляют 10—60 мкмоль формальдегида (водный раствор, 3,7%). Меченный тритием боргидрид натрия растворяют в воде или в смеси вода/изопропанол в соотношении 1 + 1, или в 0,1 М NaOH. Радиоактивность реагента должна составлять приблизительно 70 МБк/мкл.

После 30-минутной инкубации несвязавшуюся радиоактивную метку отделяют на колонке с сефадексом G-25. Меченый продукт стабилизируют добавлением 10% сыворотки плода коровы.

Прочие реагенты

Антитела и фрагменты антител можно маркировать мечеными алкилирующими агентами: йодуксусной кислотой, этилметан-сульфонатом, 1-фтор-2,4-динитробензолом. Обычно используют алкилирующие агенты, меченные тритием. Белки можно метить тритированным N-сукцинимидил-2,3-пропионатом (ацилирсмвание). Этот метод пригоден для маркирования моноклональных антител. Алкилирующие агенты взаимодействуют с белками при щелочных значениях рН, связываясь с остатками лизина, гистидина или сульфгидрильными группами.

Мечение путем биосинтеза

Этот метод основан на включении в состав всех клеточных структур аминокислот, меченных 3[Н] или 14[С], за счет метаболизма клеток in vivo или in vitro. Для этой цели могут применяться самые разнообразные аминокислоты, но чаще используют лейцин и лизин, которые встречаются практически во всех белках. Культуру клеток метят в СO2-инкубаторе в течение 12 ч. Если планируются радиоавтографические исследования, то предпочтение отдается метионину, меченному 35[S].