Главная



Иммунология и вакцинация

Антитела, меченные ферментом

Принцип метода

Конъюгаты ферментов с антителами применяются в иммуноферментном анализе или в иммуногистохимии. В иммуногистохимии находят применение пероксидаза хрена, глюкозооксидаза, кислая и щелочная фосфатазы, цитохром С; в ИФА — щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и β-галактозидаза. Используют следующие методы получения конъюгатов.

1. «Сшивание» глутаровым альдегидом.

а) одноступенчатый метод (щелочная фосфатаза);
б) двухступенчатый метод (пероксидаза хрена).

2. Конъюгирование после перйодатного окисления углеводов в составе гликопротеидов (пероксидаза хрена).

3. «Сшивание» N,N´-о-фенилендималеимидом (β-галактозидаза).

4. «Сшивание» m-малеиимидобензоил-N-гидроксисукцинимидом (β-галактозидаза).

Интактным молекулам IgG следует предпочесть Fab´-фрагменты, поскольку их специфическая адсорбция меньше. Для снижения уровня фона используют специфические Fab´-фрагменты. Fab´-фрагменты с незаблокированными SH-группами присоединяют к р-галактозидазе через N,N´-о-фенилендималеимид, который избирательно реагирует с сульфгидрильными группами. После блокады SH-гpyпп N-этилмалеимидом или преобразования Fab´- в Р(аb´)2-фрагменты конъюгирование с ферментом можно проводить глутаральдегидным или перйодатным методом. Количество N-этилмалеимида, необходимое для блокады SH-групп, определяют по интенсивности поглощения на волне 310 нм. После взаимодействия с SH-группами поглощение N-этилмалеимида на волне 310 нм исчезает. m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир реагирует как с аминогруппами (гидроксисукцинимидный эфир), так и с SH-группами (малеимидная часть). В первую очередь реагируют аминогруппы антител, во вторую — SH-группы ферментов. Поскольку у антител нет свободных SH-групп, полимеризация не происходит.

Одноступенчатый глутаральдегидный метод приготовления конъюгатов антител с щелочной фосфатазой

Материалы и оборудование. Для работы необходимы щелочная фосфатаза в (NH4)2S04, IgG (антитела), глутаровый альдегид, ФСБ; трис-HCl-буфер с рН 8,0, БСА, азид натрия.

Методика.

К 2 мг иммуноглобулина в 1,0 мл ФСБ добавляют 5 мл щелочной фосфатазы и диализуют смесь 18 ч при 4°С против ФСБ. Добавляют к смеси глутаровый альдегид до конечной концентрации 2 г/л и оставляют на 1—2 ч при комнатной температуре. Ставят на диализ в течение ночи при 4°С против ФСБ, затем против 0,05 М трис-НСl-буфера с рН 8,0. После диализа смесь доводят до объема 4 мл трис-НСl-буфером с рН 8,0, содержащимбычьий сывороточный альбумин(10 г/л) и NaN3 (0,2 г/л).

Двухступенчатый метод глутаральдегидного «сшивания» пероксидазы хрена с антителами

Материалы и оборудование.Пероксидаза хрена, глютаровый альдегид, сефадекс G-25, 0,1 М фосфатный буфер с рН 6,8, 0,15 М NaCl; антитела (IgG или Fab´), 0,1 М карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,5, лизин, сульфат аммония, центрифуга, хроматографическая колонка размером 0,9х60 см.

Методика.

Растворяют 10 мг пероксидазы в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 12,5 г/л глутарового альдегида. Через 18 ч инкубации при комнатной температуре смесь наносят на колонку (см. выше) с сефадексом G-25, уравновешенным 0,15 М NaCl. Фракции, содержащие активированную пероксидазу (экстинкция при 403 нм), объединяют и при необходимости концентрируют (мембрана Diaflo-PM-10). К этому раствору добавляют 5 мг антител (IgG) или 2,5 мг Fab´ в смеси, состоящей из 1 мл 0,15 М NaCl и 0,1 мл 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера. Через 24 ч инкубации при 4°С добавляют 0,1 мл 0,2 М раствора лизина. Еще раз 2 ч ставят на диализ против ФСБ. Меченные ферментом антитела осаждают сульфатом аммония (50% насыщения), отмывают тем же раствором и диализируют против ФСБ. Стадию осаждения сульфатом аммония опускают при работе с меченными ферментом Раb-фрагментами. Их центрифугируют 20 мин при 20 000 g и хранят до 3 мес при 4°С в неразведенном состоянии.

Перйодатный метод конъюгирования пероксидазы хрена с антителами

Принцип метода. В результате перйодатного окисления углеводов в углеводсодержащих ферментах образуются альдегидные группы, которые взаимодействуют с аминогруппами антител. Продукт реакции стабилизируют восстановлением боргидридом натрия. Материалы и оборудование. Для работы необходимы пероксидаза. хрена (Rz=3), перйодат .натрия, сефадекс G-10 или (G-25, ацетатный буфер с рН 4,0, антитела (IgG соотв. Fab´), карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,5, боргидрид натрия, ФСБ; сефакрил S-200; колонки размером 2,5х30 см и 1х30 см.

Методика.

Растворяют 4 мг пероксидазы хрена в 1 мл дистиллированной ;воды. Прибавляют 5 мкл раствора метаперйодата натрия (38,5 мг/мл). Выдерживают 20 мин при комнатной температуре и фильтруют через небольшую колонку с сефадексом G-10 или G-25, уравновешенную 0,001 М ацетатным буфером с рН 4,0. Собирают окрашенные фракции, содержащие пероксидазу, ,и доводят рН до 9,5 0,2 М NaOH. Сразу после этого добавляют :10 мг IgG или 5 мг Fab´ в 1 мл 0,01 М натрий-карбонатного буфера с рН 9,5. Через 2 ч постоянного перемешивания при комнатной температуре добавляют 100 мкл раствора боргидрида натрия (4 мг/мл в дистиллированной воде). Инкубируют 2 ч при 4°С и ставят на диализ против ФСБ в течение ночи. Проводят гель-фильтрацию на сефакриле S-200 (колонка 2,5х30 см) в ФСБ. При использовании Fab´ собирают пик с отн. мол. массой 90 000, при использовании IgG — пик с отн. мол. массой 200000. Эти пики обладают выраженной абсорбцией как на волне 280 нм, так и на 403 нм. К конъюгату пероксидазы добавляютбычьий сывороточный альбуминдо конечной концентрации 10 мг/мл. Аликвоты конъюгата сохраняют в стеклянных сосудах при —20°С.

Конъюгирование β-D-галактозидазы при помощи фенилендималеимида

Принцип метода. N,N´-о-фенилендималеимид реагирует с SH-группами в мягких условиях. Вначале восстанавливают дисульфидные мостики в молекулах антител. Затем проводят реакцию с малеимидом. Удаляют избыток малеимнда. Проводят реакцию SH-содержащего фермента с β-галактозидазой.

Материалы и оборудование. Для работы необходимы IgG, меркаптоэтиламин, фосфатные буферы (рН 6,0, 7,0, 7,5), ацетатный буфер с рН 7,5 и 5,0, сефадекс G-25, сефароза 6 В; N'-о-фенилендималеимид, N-этилмалеимид, БСА; NaCl, MgCl2, β-D-галактозидаза (5 мг/мл; 2,2 М (NH4)24; 5—10 мкмолей о-нитрофенил-β-D-галактозида/сек Х мг при 37°С рН 7,3), азид натрия, колонки (1,5х40 и 1,0х40 см), азот.

Методика.

Диализуют 4—8 мг IgG против 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,0. IgG, отдиализованный в объеме 0,9 мл, смешивают с 0,1 мл 0,1 М 2-меркаптоэтиламина и инкубируют 90 мин при 37°С. Проводят гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25 (1,0х40 см) в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0. Колонку предварительно дегазируют и хранят в атмосфере азота. Элюат с восстановлением IgG немедленно при непрерывном помешивании переносят в насыщенный раствор N,N´-o-фенилендималеимида (около 0,75 мМ в 0,1 М ацетатном буфере с рН 5,0). Реакцию проводят в атмосфере азота при 30°С. Соотношение N,N´-о-фенилендималеимида с антителами составляет 30:1. Через 20 мин смесь разделяют на сефадексе G-25-(1,0х40 см) в 0,02 М ацетатном буфере с рН 5,0. Фракцию малеимид-IgG концентрируют на мембранах до объема 0,15— 0,5 мл н 0,25 М фосфатным буфером с рН 7,5 доводят рН до 6,5. Затем добавляют 20 мкл растворабычьий сывороточный альбумин(25 г/л), обработанного N-этилмалеимидом, 1 мкл 1 М MgCb и 0,1 мл β-D-галактозндазы (5 мг/мл). Конечный объем пробы составляет 0,25—0,6 мл. Смесь выдерживают 24 ч при 4°С и доводят ее объем до 1,0 мл 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,0, содержащим 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCl2,бычьий сывороточный альбумин(1 г/л) и азид натрия (1 г/л). В этом буфере проводят фильтрацию на сефарозе 6 В (колонка размером 1.5х40).

Конъюгирование β-D-галактозидазы при помощи m-малеимидобензоиол-N-гидроксисукцинимидного эфира (МБГСЭ)

Принцип метода. Гидроксисукцинимидный эфир селективно реагирует с аминогруппами, малеимидный остаток — с SH-группами (β-D-галактозидазы).

Материалы и оборудование. Для работы необходимы IgG (антитела), β-D-галактозидаза, МБГСЭ, диоксан, 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,0, NaCl, MgCl2, 2-меркаптоэтанол, 0,01 М трис-HCl-буфер с рН 7,0, БСА, азид натрия, сефадексы G-25 и G-200.

Методика. Вносят 0,32 мг МБГСЭ в 15 мкл диоксана в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0 с 50 мМ NaCl, содержащего 1,5 мг специфического IgG. Смесь инкубируют при 30 °С в течение 1 ч, затем наносят на сефадексе G-25 (0,9х30 см) и проводят разделение в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl и 10 мМ MgCl2. Элюат (3 мг), в котором содержится белок, немедленно смешивают с 1,5 мг β-D-галактозидазы в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,0, содержащем 10 мМ MgCb и 50 мМ NaCl. Инкубируют 1 ч при 30 °С и останавливают реакцию 2-меркаптоэтанолом в конечной концентрации 10 мМ. Неконъюгированные АТ (антитело) удаляют гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (колонка 0,9X90 см). Хроматографию проводят в буфере следующего состава: 10 мМ трис-HCl с рН 7,0, 10 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 450 мМ NaCl. Конъюгированные антитела выходят вслед за свободным объемом. Их хранят в присутствиибычьий сывороточный альбумин(1 г/л) и азида натрия (0,2 г/л).

Дополнительные замечания

Меченные пероксидазой антитела можно очищать от неконъюгированного иммуноглобулина на ультрагеле АсА-44, на КонА-сефарозе (связывание пероксидазы или ее конъюгатов) и на протеин-А-сефарозе. Элюцию с протеин-А-сефарозы проводят 0.1 М глицин-HCl с рН 2,8. Элюцию с КонА-сефарозы проводят 0,1 М α-метилманнозидом в 0,1 М ацетатном буфере с рН 6,0 с 1 М NaCl, 0,001 М MgCl2 и 0,001 М СаС12.

1. Соотношение пероксидаза: IgG определяют следующим образом:

2. Концентрацию IgG в конъюгате:

Е 280 IgG = E 280 конъюгата — Е 280 пероксидазы, где Е — оптическая плотность.

Молярное соотношение:

Отн. мол. масса пероксидазы хрена 40000. Активность галактозидазы проверяют по гидролизу 4-метилумбиллиферил-β-D-галактопиранозида или о-нитрофенил-β-D-галактозида. Субстратом для щелочной фосфатазы служит 4-нитрофенилфосфат. Эффективность конъюгирования глутаральдегидом в одно-и в двухфазном методе невысока. Конъюгат, полученный двухфазным методом, более гомогенен, соотношение в нем пероксидазы и иммуноглобулина не равно 1. Эффективность конъюгирования перйодатом выше, чем у глутарового альдегида.