Главная



Иммунология и вакцинация

Иммуносорбенты. Оценка метода

У глутаральдегидно-белкового иммуносорбента специфическая биологическая активность белка проявляется только на поверхности частиц геля. По сравнению с белковым гелем активная поверхность сефарозных иммуносорбентов существенно выше. Для повышения степени конъюгации количество бромциана вместо обычных 100—150 мг увеличивают до 300 мг на 1 мл сефарозы. Бромциан перед употреблением можно растворять не только в воде, но, например, в диоксане. Контроль рН не проводят, когда бромциан растворен в ацетонитриле (метод Б), причем бромциановый раствор добавляют очень медленно, чтобы избежать преципитации бромциана. Конъюгация белка с активированными бромцианом сорбентами лучше всего протекает при рН 8—10. Если лиганды теряют активность вследствие слишком прочной конъюгации, то процесс присоединения лиганда проводят при рН 7. Буфер для конъюгации не должен содержать аминогрупп (как, например, трисаминометановые буферы).

АН-сефароза 4 В и СН-сефароза 4 В представляют собой коммерческие продукты, полученные присоединением 1,6-диаминогексана или соответственно 6-аминокапроновой кислоты к сефарозе 4 В, активированной бромцианом. При помощи реакции с карбодиимидами, например с 1-этил-3-диметиламинопропилкарбодиимид-HCl, к АН-сефарозе можно присоединять лиганды с карбоксильными группами, к СН-сефарозе — лиганды со свободными аминогруппами. Эпоксиактивированная сефароза 6 В способна связывать лиганды с одной свободной аминогруппой. Эпоксисефарозу получают взаимодействием сефарозы 6 В с 1,4-бис (2,3-эпокси-пропокси) бутаном. Эпоксисефароза пригодна для присоединения лигандов через гидроксильные группы сахара или сульфгидрильные группы. Белок присоединяется к эпоксисефарозе прочнее, чем к бромциан-сефарозе.

Неспецифическую адсорбцию белков на протеин-сефарозный конъюгат, обусловленную наличием основных групп на белке, конъюгированном с сефарозой, можно подавить анионным красителем голубым декстраном. Для получения иммуносорбентов пригодны также активированный бромцианом сефадекс G-200 или сефароза 6 MB с крупными гранулами. При помощи аффинной хроматографии можно разделять клетки с различными мембранными рецепторами, например лимфоциты, причем не обязательно использовать иммуносорбенты на основе бромциан-сефадексов или сефарозы. Клетки можно присоединять к планшетам для микротитрования через поли-L-лизин и глутаровый альдегид, после чего поверхностные антигены этих клеток легко выявляются при помощи ИФА.

Антитела можно также выявлять при помощи антигена, конъюгированного с бромцианцеллюлозой. Описаны иммуносорбенты, получаемые за счет формирования сетевых структур, подобных белковым полимерам, образующимся при обработке глутаровым альдегидом. Сетевые структуры образуются под воздействием на белки этилхлорформиата или N-ацетилмоноцистеинтиолактона. Кроме того, в качестве носителей для белковых конъюгатов можно использовать парааминобензилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, бромацетилцеллюлозу, полиаминостирол, гидразидные производные полиакриламида, активированный глутаровым альдегидом гель полиакриламида и агарозы или полиакриламид.