Главная



Иммунология и вакцинация

Образование антител культурами клеток

Материалы, оборудование, подготовка стеклянной посуды
Приготовление питательных сред
Получение суспензии клеток селезенки
Получение суспензии эритроцитов
Получение культур клеток
Оценка антителообразования
Модификации метода
Оценка метода

Метод, описанный в данном разделе, основан на способности суспензии клеток лимфоидных органов формировать культуры, продуцирующие антитела вне исходного организма. Образования антител in vitro можно добиться различными путями:

1. От животных, подвергшихся стимуляции определенным антигеном, получают культуру клеток, которые продолжают in vitro синтезировать антитела без дополнительного введения антигена.

2. От иммунизированных животных после угасания иммунного ответа получают культуру клеток. Повторное введение того же антигена вызывает вторичный иммунный ответ in vitro.

3. Культуру клеток, полученных от неиммунизированного животного, используют для выработки первичного иммунного ответа путем непосредственного контакта с антигеном.

Индукция первичного иммунного ответа, сопровождающаяся проявлением in vitro всех этапов полного гуморального иммунного ответа, методически наиболее трудна. Удовлетворительные результаты впервые были получены в 1967 г. одновременно тремя группами исследователей. Методы, предложенные Mishell и Dutton (рисунок а) [Mishell R., Dutton R. W. Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice. —J. Exp. Med., 1967, 126, 423] и Marbrook (рисунок б) [Marbrook J. Primary immune response in cultures of spleen cells. — Lancet, II, 1667, 1279], получили широкое распространение и стали стандартными методами. Позднее к ним добавился метод микрокультивирования Lefkovitz (рисунок в) [Lefkovits I. Induction of antibody forming cell clones in microcultures.— Europ. J. Immunol, 1972, 2, 360].

Системы культивирования клеток для выявления антителообразования

Системы культивирования клеток для выявления антителообразования

а — по методу Mishell и Datton;
б — по методу Marbrook;
в — по методу Lefkovitz.

При всех трех способах получения культур клеток используется исходная питательная среда, обогащенная специфическими добавками и сывороткой плода коровы. В питательную среду вносят антиген (обычно эритроциты барана, ЭБ) и суспензию клеток (чаще спленоциты, или какую-либо субпопуляцию спленоцитов мыши); инкубацию проводят в течение 3—7 дней в атмосфере, обогащенной СО2.

При наиболее распространенном способе культивирования, предложенном Mishell и Dutton, используют пластиковые чашки Петри небольшого размера. Этот способ очень прост в исполнении, однако для оптимизации роста клеток требуются питательные добавки. Система выращивания клеток, предложенная Marbrook, основана на использовании стеклянных сосудов, нижняя часть которых закрыта мембраной, непроницаемой для клеток, но пропускающей питательные вещества. Клетки растут на поверхности мембраны. Сосуд с клетками погружают в сосуд большего размера с питательной средой. Хотя такой метод требует больших затрат рабочего времени и материалов, он позволяет оптимизировать процесс питания клеток. Его преимуществом является и то, что в одном сосуде можно использовать несколько мембран, каждая из которых «заселена» клетками одного типа.

Lefkovitz предложил использовать планшеты для микротитрования, что позволяет обходиться небольшими количествами среды и клеток. Правда, при этом способе нет возможности получать антителообразующие клетки в значительных количествах. Преимуществами его являются простота реализации, малый расход реактивов, возможность выделения отдельных клонов клеток. Мы приводим описание модифицированного метода Mishell и Dutton, получившего наибольшее распространение [Wichner S, Dorfling P., Hilscher H. Beitrag zur Methode der Antikorperbil-dung in Zellkulturen. — Allergie und Immunol, 1973, 19, 155].