Главная



Иммунология и вакцинация

Опосредованная клетками цитотоксичность

Традиционно различают тест на высвобождение 51[Сг] и микроцитотоксический тест. Речь идет не о миниатюризации эксперимента, а о продолжительности инкубации. Поэтому предпочтительнее использовать термины «быстрый и «медленный» тест. В дальнейшем и те и другие термины будут использоваться в равной степени.

«Быстрый» тест. Тест основан на маркировании клетки-мишени радиоактивным Na2Cr2О4. 51[Cr] представляет собой γ-излучающий изотоп с энергией квантов 323 кэВ и периодом полураспада 27,8 дня. Большая часть клеток включает его в цитоплазму, где и происходит восстановление до трехвалентного хрома. Высвобождение хрома происходит только вследствие разрушения мембраны. Повторного включаения хрома в живые клетки не наблюдалось. Лимитирующим фактором для применения 51[Cr] является высокий уровень спонтанного высвобождения. Время инкубации составляет 2—24 ч. Тест предназначен для оценки цитолитической активности самых различных эффекторных клеток. Количественная оценка результатов облегчается, если построена кривая зависимости доза — эффект, по которой определяют цитотоксичность при различных соотношениях эффекторные клетки — клетки-мишени.

Известна очень чувствительная модификация реакции торможения, в которой смешивают меченые и немеченые клетки-мишени, что приводит к конкурентному торможению. По кривым титрования можно судить о мембранных антигенов и об их взаимодействии с цитотоксическими лимфоцитами. На практике применяют большое количество различных вариантоз мечения и высвобождения метки. Для длительной инкубации применяют 3[Н]-пролин, 125[I]-дезоксиуридин, 3[Н]-уридин.

«Медленный» тест. Определяют количество клеток-мишеней после инкубации с эффекторными клетками. Этот эксперимент отличается от пробы с высвобождением 51 [Сг] по количеству клеток-мишеней для визуальной оценки (200—300), по способу культивирования, по длительности инкубации (более 24 ч) и по форме представления результатов. Помимо вышеперечисленных изотопов, для маркировки используют 86[Rb]Cl, 99m[Tc]О4, 75[5е]-метионин и 3[Н] -лейцин. Мечение клеток-мишеней можно проводить до и после инкубации с учетом свойств меченых соединений.

Комбинация двух способов маркирования позволяет в одном и том же эксперименте учитывать цитолитический и цитотоксический эффекты. Продолжительное время инкубации дает возможность исследовать влияние роста и деления клеток на цитолитическую активность эффекторных клеток. Считается, что в "медленном" тесте определяют зависимую от Т-клеток активность, которая в первые 24 ч совпадает с результатами, полученными в "быстром" тесте. На более поздних стадиях происходит реактивация нелитических вторичных Т-клеток, которые сами по себе не обладают цитотоксичностью. При помощи микроцитотоксического теста можно исследовать реакции клеточного иммунитета в течение значительно более длительного времени после аллоиммунизации, чем это позволяет сделать тест с высвобождением 51[Cr].

Спонтанная клеточная цитотоксичность. Из довольно старого наблюдения, что лимфоциты нормальных доноров с различной степенью эффективности реагируют с опухолевыми клетками-мишенями, развился метод характеристики маркеров тимуснезависимых лимфоцитов. Естественные цитотоксические клетки присутствуют в неодинаковых количествах у различных биологических видов. Как правило, это мононуклеары, возможно промоноциты. NK-клетки не способны к адгезии и фагоцитозу, у них нет рецептора СЗ и отсутствуют мембранные иммуноглобулины. Наличие в этих клетках Fc-рецептора несущественно для осуществления литического процесса. В отличие от К-клеток контакт с клетками-мишенями осуществляется не за счет антител. Обсуждался вопрос о различной авидности Fc-рецепторов К- и NK-клеток. Поскольку оба типа клеток встречаются в одной и той же субпопуляции лимфоцитов, предполагают, что различия их активности обусловлены разными пусковыми механизмами. NK-клетки мыши теряют активность при 37 °С. На процесс индукции in vitro оказывает влияние характер культивирования (добавки к питательной среде). Интерферон и индукторы интерферона стимулируют активность NK-клеток. Как и в случае Тс-клеток, культивирование и клонирование NK-клеток может изменять их свойства. NK-клеткам приписывают важную роль в осуществлении противоопухолевого контроля.

Методика

На простых животных моделях можно поставить реакцию опосредованной клетками цитотоксичности, в которой после алло-генной иммунизации in vivo и in vitro, например, после имплантации химически индуцированной опухоли, определяют цитотоксические лимфоциты. Клетки-мишени могут быть представлены в виде монослоя или в виде суспензии.

Используют следующие среды: Культуральная среда I: среда Игла-MEM с 0,02 М ГЭПЭС, 100 г телячьей сыворотки на 1 л, 100 000 ЕД пенициллина на 1 л, 0,1 г стрептомицина на 1 л.

Культуральная среда II: RPMI 1640 с 0,004 М глутамина на 1 л, 0,01 М ГЭПЭС, 0,01 М NaHCOs, 0,00002 М меркаптоэтанола, 100000 ЕД пенициллина и 0,05 г стрептомицина на 1 л, 10% телячья сыворотка.

Сцинтилляционная жидкость: 4 г РРО, 0,2 РОРОР, 60 г нафталина, 100 мл метанола, 20 мл этиленгликоля, диоксан до 100 мл.