Главная



Иммунология и вакцинация

Метод иммунных розеток. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: среда Игла или Паркера, ФСБ с рН 7,2, состоящий из 9 частей 0,15 М NaCl и 1 части фосфатного буфера по Серенсену. Цельная кровь в растворе Олсвера (1 + 1) сохраняет пригодность в течение 8 дней в холодильнике (4°С). Нужны также центрифужные пробирки (10 мл), гематокритная центрифуга, камера для подсчета клеток (камера Barker).

Этапы работы

Вся работа, за исключением подсчета розеток, проводится при О - 4°С. Приготовление суспензии клеток из лимфоидных органов см. Метод локального гемолиза. Клетки трижды отмывают средой Игла и доводят концентрацию до 107 живых клеток на 1 мл суспензии. Трижды отмытые в ФСБ эритроциты при помощи гематокритной центрифуги переводятся в 5% суспензию (приблизительно 109 клеток на 1 мл).

Инкубация: 0,9 мл клеточной суспензии исследуемого органа смешивают в стеклянной пробирке с 0,1 мл суспензии эритроцитов и инкубируют в течение ночи (16 ч) на ледяной бане. Затем добавляют 4 мл охлажденной среды (разведение 1:5). Суспензию осторожно перемешивают и вносят одну каплю при помощи пипетки с широким концом в счетную камеру, после наложения покровного стекла подсчитывают розетки. В качестве РОК учитывают клетки не менее чем с 4 присоединившимися эритроцитами. Число РОК относят к 103 или 106 лимфоидных клеток. Число клеток, находящихся в суспензии, можно уменьшить, если при подсчете будет иметься достаточно репрезентативное число лейкоцитов.

Модификации метода

Т-РОК связывают, как правило, меньше эритроцитов, чем В-клетки, и легче диссоциируют при ресуспендировании. В связи с этим необходимо фиксировать розетки глутаровым альдегидом. После инкубации при 4°С и осторожного ресуспендирования добавляют 2,5% раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,6%, перемешивают и инкубируют 25 мин при 4°С. Центрифугируют 5 минут при 800g, надосадочную фракцию отбрасывают.

Дифференцирование розеток от неспецифических скоплений эритроцитов проводят при помощи окраски толуидиновым синим (1 капля 1% раствора). Для выделения функционально не измененных РОК (например, сепарация) диссоциацию нестабильных Т-розеток подавляют добавлением азида натрия до 0,05%.