Главная



Иммунология и вакцинация

Метод мембранной иммунофлюоресценции. Контроль специфичности

Контроль специфичности на модельных объектах.

A. Наилучший контроль специфичности проводят с использованием стабильных клеточных линий с известными мембранными маркерами, такими как RPMI Molt 4Т (Smlg -, Fc -, Сз -) или Raji (Smlg -, Fc+, Сз +). Можно также использовать охарактеризованные лейкемические клетки (например, В-лимфоциты при хроническом лимфолейкозе) или клетки плазмацитомы. Отмытые эритроциты АВ используют для оценки неспецифического связывания в прямой и непрямой МИФ. Если имеется более или менее чистый препарат исследуемого антигена, то, присоединив его к инертному носителю, частичкам агарозы или се-фадекса, можно создать модель для проверки контроля специфичности.

Контроль специфичности исследуемого объекта (непрямой метод).

Б. Вместо Ig против антигена человека (например, кроличьего) применяют нормальную сыворотку или γ-глобулин кролика. Необходимо с помощью этих реагентов исключить неспецифическое связывание сывороточных белков кролика, в особенности γ-глобулинов.

B. Реакция торможения I: перед инкубацией с Ig кроликов против антигена человека проводят инкубацию с аналогичным Ig козы. Места связывания кроличьего Ig блокируются и происходит торможение связывания антикроличьих γ-глобулинов (2-е антитела). Торможение имеет место в случае специфичности Ig кролика против антигена человека.

Г. Реакция торможения II: перед инкубацией антикроличьего γ-глобулина, меченного флюорохромом, проводят инкубацию с немеченым антикроличьим γ-глобулином. Этот способ применяется для проверки специфичности вторых антител.

Д. Вместо меченого антикроличьего γ-глобулина используют антикозий γ-глобулин. Эта операция применяется для поверки неспецифического связывания с клетками меченых AT, а также для контроля неспецифических «сэндвичей» с немеченым античеловеческим Ig.

Е. Ig против антигена человека вообще не используется. Инкубацию проводят исключительно с меченым антикроличьим γ-глобулином (прямая проба со вторым антигеном), исключая неспецифическое связывание меченых АТ (антитело) или свободного флюорохрома.

Контроль специфичности исследуемого объекта (прямой метод).

Ж. Вместо меченого Ig против антигена человека применяют меченую АС другой специфичности или нормальную сыворотку (можно препарат γ-глобулина) для проверки на неспецифическое связывание с мембранами.

3. Реакция торможения: перед инкубацией с меченым Ig против антигена человека проводят инкубацию с тем же, но немеченым Ig для предотвращения связывания меченых АТ (антитело) с Smlg (поверхностный мембранный Ig).

Особо важное значение имеют контроли А, Б, В. Контроль специфичности на модельных объектах должен по возможности проводиться при оценке новых партий антисывороток, с тем чтобы можно было получать сравнимые результаты. Контроль специфичности на исследуемом объекте должен проводиться при каждом анализе. Контроль Б проводят с использованием одинаковых концентраций специфических и неспецифических сывороток. Реакция торможения при постановке МИФ имеет некоторые сложности, связанные со специфичностью взаимодействия эпитопов с паратопами.

При постановке непрямого МИФ даже в условиях избытка специфических тормозящих AT могут обнаруживаться МИФ-позитивные лимфоциты. Это позволяет предположить существование обмена специфических АТ (антитело) на клеточной мембране в соответствии с равновесным состоянием, при котором высоко-авидные АТ (антитело) обмениваются с АТ (антитело) невысокой авидности.

Контроли Д и М могут быть полезными для выяснения причин грубых неспецифических реакций в методе двойных AT.