Главная



Иммунология и вакцинация

Метод мембранной иммунофлюоресценции. Возможные ошибки и способы их устранения

Антитела и конъюгаты

Основная причина ошибок — неспецифическое связывание меченых АТ (антитело) с исследуемым объектом.

Неспецифическое флюорохромирование. Конъюгаты, содержащие много свободного флюорохрома, могут при недостаточном разведении и плохой отмывке вызывать неспецифическое окрашивание (контроль Г).

Неспецифическое связывание белков. Конъюгаты могут содержать посторонние белки, меченные флюорохромом. Эти белки могут неспецифически откладываться на клеточных мембранах. Рекомендуется проводить в таких случаях усиленную отмывку, если это не помогает, стараются подобрать оптимальное разведение конъюгата или адсорбировать конъюгат ацетоновым порошком ткани. Конъюгация белка с флюорохромами может сама по себе вызывать изменение его свойств (уменьшение растворимости, сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, изменение антигенсвязывающей способности), поэтому желательно в процессе конъюгации не использовать чрезмерно высокие дозы флюорохрома. Неконъюгированные белки аутологической сыворотки могут откладываться сами по себе на объекте, если они не удаляются отмыванием, на последующих этапах работы это может приводить к неспецифическому связыванию конъюгата.

Неспецифическое связывание с Fc-pецепторами. Fc-рецепторы обнаруживаются на В-лимфоцитах, активированных Т-лимфоцитах, гранулоцитах, моноцитах и даже тромбоцитах.

Типы флюоресценции нелимфоидных клеток, предположительно обусловленной наличием Fc-рецепторов

Типы флюоресценции нелимфоидных клеток, предположительно обусловленной наличием Fc-рецепторов

а - МИФ+ - гранулоцнт; б - МИФ+ - моноцнт

Они обладают способностью связывать ИК и агрегированные Ig по Fc-фрагменту. ИК или измененные Ig, присутствующие в используемых АС и конъюгатах, могут неспецифически связываться с клетками, стимулируя картину МИФ. Этого можно избежать, используя Р(аb)2-фрагменты.

Комплексы и агрегаты можно удалить ультрацентрифугированием. Поскольку реагрегация протекает довольно быстро, центрифугирование следует проводить перед каждым анализом.

Недостаточная специфичность антисывороток и антител АТ (антитело) с посторонней специфичностью, т. е. не к мембранным антигенам (например, β2-микроглобулину), могут искажать результаты опыта. Полезным может оказаться обогащение препарата специфическими AT. Оно предполагает изготовление нерастворимого иммуносорбента, который инкубируют с АС и затем элюируют специфически связавшиеся AT.

Тест-система и оценка результатов

При аккуратной работе можно ограничиться использованием 3х106 клеток на одну пробу. Для сепарированных лимфоцитов должно быть не менее 70% от теоретически ожидаемого уровня, чтобы не слишком сильно искажать состав клеточных популяций. Для предотвращения слишком быстрого «Capping» или высвобождения мембранных антигенов инкубацию можно проводить при 4°С. Такого эффекта можно добиться прибавлением 50 мг/л митомицина и 0,02 моль/л азида натрия в ФСБ. Существует возможность того, что связанные с клетками антилимфоцитарные аутоантитела (в случае аутоиммунных заболеваний, иммунных дефектов и инфекций) могут обусловливать ложноположительную МИФ. В физиологических условиях может иметь место перераспределение мембранных антигенов, поэтому рекомендуется проводить оценку результатов МИФ немедленно.

Моноциты и гранулоциты могут связывать Ig за счет Fc-рецепторов и становиться МИФ-положительными клетками. Их следует дифференцировать по морфологическим критериям ( величина, соотношение ядро - плазма, анализ в фазовом контрасте) и исключать при подсчете.

Оснащение оптическими приборами

Для МИФ необходима оборудование, используемое в люминесцентной микроскопии, включая интерференционные фильтры и разделяющие зеркала. Микроскопия в проходящем свете используется только в особых случаях, для этого служит интерференционный фильтр. Самые небольшие изменения, такие как положение конденсора и недостаточная центровка источника света, могут исказить результаты анализа. Апертура конденсатора должна быть всегда полной. Количество света, попадающего в препарат, можно увеличить, если на верхнюю линзу конденсора нанести одну каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Для предотвращения ошибочных заключений необходимо сравнение результатов флюоресцентного анализа с фазово-контрастным изображением, это обязательное условие.