Главная



Иммунология и вакцинация

Реакция гемагглютинации. Оценка метода

При помощи РГА определяют антиэритроцитарные антитела. Особенно часто РГА используется при определении групп крови. Пассивная гемагглютинация относится к числу наиболее чувствительных полуколичественных методов определения антител к растворимым антигенам. При помощи РПГА можно определять до 3—6 нг азота антител. В смысле чувствительности РПГА равна или даже превосходит РСК. РПГА более чувствительна в отношении IgM, чем IgG. Из этого становится ясным, что изменение титра РПГА связано не только с количеством антител, но и с различным их составом. Различия результатов титрования низко- и высокоаффинных антител могут быть уравнены путем большей антигенной нагрузки эритроцитов. С увеличением плотности антигенных детерминат улучшаются результаты титрования низкоаффинных антител.

Склонность сильно «нагруженных» антигенами эритроцитов к спонтанной агглютинации может быть предотвращена увеличением концентрации стабилизаторов в среде для суспендирования и разведения. Из вышеизложенного становится ясно, что самый важный параметр конъюгирования антигенов с эритроцитами — это плотность антигенных детерминант. Оптимальное количество антиген для «нагрузки» эритроцитов — то, которое дает максимальный титр РПГА. С эритроцитами связывается менее 2% вносимого антигена. Вышеупомянутое различие в чувствительности РПГА при определении IgM и IgG не может быть решено с помощью пробы Кумбса (антиглобулиновый тест), поскольку необходимые для этой пробы антител неспецифически адсорбируются на сенсибилизированных эритроцитах. Это также означает, что в РПГА невозможно дифференцировать различные изотипы антител при помощи антиглобулиновых сывороток.

Предложенный для этой цели Кумбсом «red cell linked-antigen antiglobulin test» не получил .признания в клинике ввиду его сложности и меньшей точности, чем радиоиммунологический анализ и ИФА. При выборе метода конъюгации белка следует тщательно взвесить преимущества и недостатки каждого метода конъюгации. Например, с таннизированными эритроцитами в равной мере связываются все белки, а с эритроцитами, обработанными БДБ, — преимущественно богатые тирозином и гистидином. Глутаровый альдегид присоединяет в основном белки с большим содержанием свободных аминогрупп. В отличие от связанных ковалентно адсорбированные антигены сравнительно легко отделяются от мембраны.

Применение фиксированных эритроцитов делает РПГА более воспроизводимым методом, к тому же отпадает необходимость получать каждый раз свежие эритроциты. Фиксирование эритроцитов глутаровым альдегидом предпочтительнее, чем обработка формалином, так как при первом способе эритроциты менее склонны к агрегации при хранении. Кроме того, появляется возможность одновременно связывать несколько белковых антигенов. Условия для оптимальной сенсибилизации эритроцитов различными антигенами, включая концентрацию таннина, температуру, рН, подбираются опытным путем. Подробные данные имеются в соответствующем обзоре.

Рекомендуются следующие оптимальные концентрации антигенов для сенсибилизации эритроцитов.

Овальбумин - 0,01—5 мг/мл
БСА - 0,04—25 мг/мл
Тиреоглобулин - 2 мг/мл
Фибриноген - 2 м кг/мл
Тканевые антигены - 20 мкг/мл по азоту

Для достоверности РПГА необходимы ежедневные позитивные и негативные контроли, которые исключают бактериальное загрязнение суспензии эритроцитов и антисывороток. Микротитрование требует меньшего количества времени и материалов, но оно сопряжено с большей вероятностью ошибок, особенно при использовании больших разведений антител. РПГА может быть автоматизирована. Ввиду высокой чувствительности и простоты РПГА стала одним из распространенных методов полуколичественного определения малых концентраций непреципитирующих антител.

В клинике РПГА используют в основном для определения аутоантител. В случае использования больших количеств антигенов и специфических антителах можно проводить количественное определение антигенов (перекрестные реакции) в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Последняя отличается довольно высокой чувствительностью и позволяет определять несколько нанограммов белка, все же радиоиммунологический анализ чувствительнее и намного точнее.