Главная



Иммунология и вакцинация

Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Постановка опыта

Ниже будет описан метод, основанный на цитолизе меченных 51Сг асцитно-лейкемических клеток мыши в присутствии специфических антител и эффекторов: сингенных перитонеальных клеток или лейкоцитов крови человека.

Материалы и оборудование

Подходящей средой является RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной сыворотки плода коровы. Для поддержания постоянного рН к сыворотке добавляют 10—20 мМ буфера на основе ГЭПЭС. Добавляемая сыворотка не должна содержать γ-глобулинов, которые могут образовывать агрегаты и тормозить АЗКЦ. Для постановки эксперимента необходимы чистые, ополоснутые бидистиллированной водой центрифужные пробирки на 10 и 20 мл, небольшие пробирки (10x10 мм) с круглым дном и пастеровские пипетки. Необходимы также Na251CrO4 (Центральный институт ядерных исследований АН ГДГ), лнм-фопреп (Nyegaard, Норвегия) или смесь фиколл — визотраст равной плотности, настольная центрифуга с бакет-ротором, счетчик γ-излучения.

Подготовка клеток-мишеней

Из полости брюшины мышей отбирают асцитическую жидкость, содержащую лейкемические клетки, индуцированные вирусом Graffi (перевивку проводят еженедельно на сингенных мышах штамма XVII/Bln. Осаждают клетки центрифугированием, суспендируют в среде и снова центрифугируют. Содержащиеся в осадке эритроциты могут быть удалены холодной водой (1 часть осадка клеток + 2 части дистиллированной воды; 10 сек). После отмывки готовят суспензию, содержащую 1— 5x107 клеток/мл. В суспензии должно быть не более 5—10% неживых клеток (окрашивание трипановым синим).

Мечение клеток-мишеней 51[Cr]

Суспензию клеток асцитической жидкости (0,15 мл) в маленькой пробирке (10X40 мм) смешивают со 100 мкКи 51[Cr] в 0,1 мл 0,15 М NaCl; инкубируют 90 минут при 37°С, часто встряхивая. Суспензию переносят пастеровской пипеткой в центрифужную пробирку, разводят небольшим количеством среды и центрифугируют 6 минут при 200 g. Надосадочную фракцию осторожно удаляют. Осадок клеток трижды промывают средой (порциями по 8 мл). Рекомендуется перед последним центрифугированием дать постоять суспензии клеток 20 минут, чтобы сорбировавшийся на внешней - мембране Na2 51[Cr]О4 мог диффундировать в среду. Готовят из осадка суспензию 2,5х105 клеток/мл. Следует указать, что не все клетки асцитической жидкости могут быть клетками-мишенями. Некоторые типы клеток характеризуются высоким спонтанным уровнем высвобождения 51[Cr]. Рекомендуется работать с линиями клеток, адаптированными к культивированию in vitro.

Приготовление антисыворотки

Кролику с интервалом в неделю делают внутривенно 5 инъекций по 108 лейкемических асцитных клеток. Через неделю после последней инъекции получают сыворотку, инактивируют ее 30 минут при 56°С и при —20°С. Для удаления видоспецифических антител сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 10 и трижды адсорбируют эритроцитами мыши (3—4 части разведенной сыворотки +1 часть осадка отмытых эритроцитов). Затем дважды на холоду адсорбируют сыворотку спленоцитами мыши (1 часть сыворотки +1 часть отмытого осадка спленоцитов; инкубация 1 ч). Специфичность сыворотки можно проверить в реакции комплементзависимой цитотоксичности с лейкемическими, а также с нормальными клетками тимуса, селезенки, брюшной полости.

Приготовление эффекторных клеток

Перитонеальные клетки мыши получают путем смыва с брюшины холодным 0,15 М NaCl или солевым раствором Хенкса; мононуклеарные лейкоциты человека получают градиентным центрифугированием гепаринизированной крови по Бейюму (Boyum). Клетки отмывают 2—3 раза, ресуспендируют в среде и подсчитывают. Для получения дозозависимого эффекта готовят несколько суспензий эффекторных клеток разной концентрации.

Постановка пробы

В маленькие пробирки (10x40 мм), двойное или тройное повторение проб, последовательно вносят по 0,05 мл среды, 0,05 мл антисыворотки, 0,2 мл суспензии клеток-мишеней и 0,2 мл суспензии эффекторных клеток (общий объем 0,5 мл). Для контроля ставят следующие пробы: клетки-мишени + + среда, клетки-мишени + антисыворотка, клетки-мишени + + эффекторные клетки. Пробирки центрифугируют (800 g; 2 минуты), при этом клетки-мишени и эффекторные клетки входят в тесное соприкосновение, пробирки закрывают резиновыми пробками и инкубируют 4 ч при 37°С. Затем добавляют по 0,5 мл охлажденного 0,15 М NaCl, осторожно, но энергично встряхивают и центрифугируют (5 мин; 1200 g). Из надосадочной фракции отбирают 0,5 мл для измерения γ-излнчения. Рациональнее проводить исследование в микропланшетах (Flow — Labs). В этом случае объем пробы составляет 0,11 мл (0,05 мл суспензии клеток-мишеней, 0,05 мл суспензии эффекторных клеток и 0,01 мл антисыворотки). Небольшое число клеток-мишеней (1х104) уравновешивается более интенсивным мечением 51[Cr].