Главная



Иммунология и вакцинация

Метод Фарра

Принцип метода. В 1958 г. Фарр предложил методику определения связывающей способности антисывороток, в принципе применимую ко всем антигенам. Модифицировав эту методику, можно также определять антитела. Сходный с ней метод радиоиммунопреципитации с использованием меченых вирусов, например вирусов полиомиелита, применяется для диагностики инфекционных заболеваний. В подтверждении диагноза системной красной волчанки (СКВ) метод Фарра нашел самое широкое применение. Для постановки эксперимента необходимо наличие радиоактивно меченых антигенов. Его иммунореактивные свойства не должны изменяться после маркировки, и он должен легко отделяться в связанном с антителом виде от нес вязавшегося антигена. Для маркировки in vitro и in vivo наиболее подходят 3[Н], 14[С], 32[Р] и 125[I]. Для облегчения седиментации связанного антитела антигена применяют насыщение сульфатом аммония но 50%. В этих условиях преципитируют ИГ, а также связанный с иммуноглобулин антиген. Для этих же целей можно использовать полиэтиленгликоля или вторую АС; в любом случае необходимым условием-остается полная растворимость антигена. По своей эффективности ультрацентрифугирование, применение второй антисыворотки и хроматография приблизительно одинаковы. Для отделения ИК можно использовать образуются ААТ к ДНК. Эта ААТ исследуют в отношении специфичности к нативной (н) и денатурированной (д) ДНК. Ниже будет описан способ, основанный на применении меченой химическим способом ДНК.

Маркирование антигена

Растворяют 0,1 мг денатурированной ДНК (содержание белка 1%) или 0,6 мг нативной ДНК (содержание белка 2%) в 0,6 мл буфера (0,1 М ацетат аммония, 0,04 М уксусная кислота» рН 5,0). Добавляют к смеси 0,1 мл К1 (0,0025 М), 1 мКи 125[I] и 0,1 мл Т1С13 (0,0015 М). После нагревания в течение 20 мин при 60°С добавляют 0,1 мл 0,05 М Na2S03 и 0,2 мл буфера с рН 9,0 (1 М уксусная кислота, 0,05 М аммиак). Нагревают еще раз в течение 20 мин при 60°С. Несвязавшийся 125[I] удаляют гель-хроматографией на сефадексе G-50 или диализом против фосфатного буфера (0,1 М Na2HP04, 0,14 М NaCl, рН 8,0, в дальнейшем обозначаемый, как буфер Фарра). Специфическая радиоактивность д-ДНК составляет 2 мкКи/мкг, а н-ДНК —0,3 мкКи/мкг.

Определение антител к ДНК

К 50 мкл разведенной в соотношении 1 + 9 буфером Фарра сыворотке пациента добавляют 0,02 мкКи меченой ДНК (100 нг), растворенной в 50 мкл буфера Фарра. В контрольные пробы добавляют такое же количество немеченой ДНК. Инкубируют смесь в течение 1 часа при 37°С и в течение 16 часов при 4°С. Добавляют 100 мкл насыщенного раствора сульфата аммония (если используют д-ДНК) или 100 мкл антисыворотки козы к углобулину человека, разведенной в соотношении 1 + 2 (если используют н-ДНК). Для определения ДНК, связанной антителами, измеряют радиоактивность 100 мкл надосадочной фракции (S) и 100 мкл надосадочной фракции, а также радиоактивность осадка (R) после центрифугирования.

Определение антител к ДНК

Определение антител к ДНК

С использованием вышеописанного метода и химически меченой ДНК в качестве антигена можно определять способность сывороток связывать антигены, а также построить кривые титрования. Кроме того, увеличивая количество ДНК в пробе при постоянном разведении сыворотки, можно сравнивать авидность антитела. При наличии сильного неспецифического связывания рекомендуется использовать детергенты или буферы с высокой ионной силой.