Главная



Иммунология и вакцинация

Радиоиммунологический анализ. Принцип метода

Характерной чертой радиоиммунологических методов является сочетание специфичности, свойственной реакциям антиген-антитело, с простотой и высокой чувствительностью определения, которые дает применение радиоактивных изотопов, введенных в состав антигенов или антител. По сравнению с обычными методами анализа преимущество радиоиммунологического анализа состоит в том, что отсутствует необходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов. Важнейшим условием использования радиоиммунологического анализа является возможность соединения измеряемой радиоактивной субстанции с компонентами реакции антиген-антитело, как, впрочем, и наличие специфических сывороток и высокоочищенных антигенов. Получение высокотитражных сывороток к большинству белковых гормонов не представляет особых сложностей. Вещества, являющиеся гаптенами, например стероиды, медикаменты и продукты их метаболизма, простагландины, циклические нуклеозидмонофосфаты, можно легко перевести в иммуногенное состояние. Антигены и антитела весьма удобны для прямого и непрямого введения радиоактивной метки. Необходимая для исследований специфическая радиоактивность метки должна рассчитываться исходя из заданной чувствительности. Радиоактивность антигенов, применяемых в радиоиммунологическом анализе, обычно составляет 100—200 мкКи/мкг, радиоактивность антител — 20 мкКи/мкг, а для модификации радиоиммунологического анализа с двойными антителами — 0,1 мкКи/мкг. Возможность проводить конкурентный анализ, а также анализ в жидкой или твердой фазе приводит к созданию большого числа различных методик. Мы рассмотрим эту проблему на четырех характерных примерах.

Радиоиммунологический анализ

Реакция антигенов с антителами приводит с течением времени к состоянию равновесия между свободным и связанным антигенов. Характерным для радиоиммунологического анализа является то обстоятельство, что меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания. После инкубации в пределах определенной области концентраций антигенов, количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Основные реакции представлены на следующей схеме:

I — специфическое антитело, II — меченый антиген, III — немеченый антиген (стандарт или образец),
IV — иммунные комплексы, состоящие из антител и меченого антигена, V — свободный меченый антиген,
VI — иммунные комплексы, состоящие из антител и немеченого антигена, VIII — свободный немеченый антиген

Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. Теоретически радиоиммунологический анализ можно проводить как вариант сатурационного анализа. В этом специальном случае связывающий компонент Q представлен специфическим антителами, метка вводится в составе антигена. Детально теоретические аспекты рассматриваются в работе Walker и Кеапе. Кроме того, определенный интерес представляют вопросы, касающиеся различий связывания меченых и немеченых антигенов, влияния температуры, авидности и концентрации компонентов реакции. Для оценки качества АС необходимо знание константы авидности К. Ее можно определить по методу Скэтчарда и Михаэлиса — Ментен. Отклонения от идеальной формы кривой можно рассматривать как выражение гетерогенности реакции связывания, которая обусловлена негомогенностью популяции антител. Наиболее удачные концентрации антител оказываются равными 3/К меченого антигена 4/К. Между чувствительностью метода (S) и авидностью существует соотношение:

S=0,l / K

Заключение о степени конкуренции между меченым антигенами и А Г исследуемой пробы можно сделать только после отделения образовавшихся ИК от несвязанного меченого антигена. Для отделения ИК используют самые разнообразные методы, основанные на различиях в растворимости, коэффициенте седиментации, заряде, молекулярной массе и др. В некоторых случаях на способ выделения ИК оказывают влияние специфические свойства исследуемого антигена. Для того чтобы разделение меченого несвязавшегося антигена и ИК было удовлетворительным, необходимо соблюдение трех условий:
1) процесс разделения не должен оказывать влияния на состояние равновесия;
2) отделение связанных с антителами молекул от несвязанных должно носить количественный характер;
3) затрата рабочего времени и стоимость процесса должны быть незначительными.

Известно много способов достижения вышеперечисленных условий. Различия в заряде и относительной молекулярной массе позволяют проводить разделение при помощи электрофореза или гель-хроматографии. В некоторых случаях возможна селективная адсорбция антигена на тонко измельченном тальке, кварце, декстране или целлюлозе, соединенных с активированным углем. Связанные антигены можно улавливать при помощи иммобилизованных антител, например полимеризованных антител, или осаждением ИК специфической АС. Конъюгация антител с железосодержащими частицами энзакрила позволяет проводить разделение в магнитном поле. Различные способы разделения антигенов и ИК требуют неодинаковых затрат времени, их воспроизводимость также неодинакова. То же самое относится к возможности автоматизации отдельных этапов анализа. Наибольшее внимание привлекают к себе в настоящее время методы, основанные на использовании двойных антител.

Известным упрощением метода является использование связанных с целлюлозой вторичных АС, так называемая технология двойных антител на твердой фазе. Оптимальное для радиоиммунологического анализа разведение АС устанавливается по 50% связыванию меченого антигена. АС в данном разведении в присутствии меченого антигена смешивается с возрастающим количеством немеченого антигена. Зависимость связывания меченого антигена от концентрации стандартного антигена можно представить в виде различных графиков. Часто используют график зависимости процента связывания меченого антигена от концентрации немеченого. Уже упоминавшиеся во введении Берсон и Ялоу предложили использовать соотношение связанного меченого антигена к несвязанному в качестве оценки концентрации немеченого антигена.

При использовании арифметических координат получается экспоненциальная кривая, полулогарифмических — кривая с прямолинейным участком, логарифмических — кривая с увеличенным прямолинейным участком. Особый интерес представляет возможность конкурентного взаимодействия с чужеродными веществами, например медикаментами. Специфичность метода оценивают также по перекрестной реактивности с применяемыми сыворотками; заключение в этом случае выносится на основании определения меченого антигена в присутствии сопутствующего антигена. Ошибки, связанные с вышеперечисленными модификациями, можно устранить, используя дополнительную очистку реагентов, что, однако, увеличивает стоимость исследования. Все чаще начинают применять моноклональные антитела для радиоиммунологического анализа. Уже описаны радиоиммунологические способы определения морфина и человеческого лейкоцитарного интерферона с использованием моноклональных или полученных аффинной очисткой антител. В случае конкурентного анализа белкового связывания вместо антисывороток используют транспортные белки. Следует учитывать, что специфичность их связывания и авидность не всегда, удовлетворительны.

Твердофазный радиоиммунологический анализ

Впервые в качестве водонерастворимого носителя для белков была применена пара-аминобензилцеллюлоза. В последующее время было описано большое количество твердых носителей, нашедших применение в секвенировании, синтезе и других манипуляциях с белками. Эти носители, соединяясь с антигеном или антителом, не изменяют их иммунологические свойства.

Полимеры, например сефадекс и сефароза, после их обработки бромцианом приобретают способность связывать белки. В дальнейшем была установлена способность многих полимеров (полиэтилен, полипропилен, полистирол), называемых обычно матрицами, связывать различные биологические макромолекулы без всякой предварительной химической обработки. Оказалось, что полимеры обладают способностью связывать антитела, которые можно использовать для определения различных гормонов (хорионического гонадотропина, лютеотропного гормона, тиреостимулирующего гормона, гормона роста и др.) методом радиоиммунологического анализа. Связанный с твердой фазой комплекс антиген-антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала, кроме того, он обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необратимо связываясь с фиксированными на матрице антитела, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологического материала. Антитела можно присоединять к активированной или неактивированной матрице. Основной проблемой будет в обоих случаях точное дозирование связавшихся с матрицей антитела.

Связывание антител с матрицей. Нефракционированные АС кроликов с известным титром нейтрализации бактериофагов ТЗ и Т4 разводили 0,1 М карбонат-бикарбонатным буфером с рН 9,6. Сыворотки в различных разведениях вносили в пластиковые пробирки по 0,5 мл. Пробирки закрывали и выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре, затем удаляли жидкую фазу. Легко десорбирующиеся антитела удаляли двукратным ополаскиванием в 0,14 М NaCl (по 1 мл). Затем проводили инкубацию с 0,01 М калий-фосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,14 М NaCl и 0,5% ЧСА, для насыщения свободных участков пластиковой поверхности нейтральным белком. Пластиковые пробирки с адсорбированными антителами можно использовать немедленно или хранить в холодильнике в течение 4 недель.

Мечение антигена. Бактериофаги ТЗ и Т4 после маркирования их 131 [I] или 125[I] сохраняют полностью иммунологическую реактивность. Иодирование проводили Т-хлораминовым методом. Специфическая радиоактивность фагов составляла 0,3—7,2 мкКи/мкг. В целом более высокая специфическая радиоактивность повышает чувствительность анализа. После удаления радиоактивного йода гель-фильтрацией через сефадекс и диализа препарат радиоактивных фагов разводят калий-фосфатным буфером с рН 7,4 (см. выше) для предотвращения радиолиза.

Оптимизация анализа. Вначале определяют оптимальное разведение антител и меченого фага для достижения максимального связывания материала с твердой фазой. Исследовалась также зависимость этих процессов от времени. На рисунке представлены данные, относящиеся к фагу Т3, меченному 131 I.

Зависимость связывания меченых фагов ТЗ с антителами, адсорбированными на пластиковой поверхности от времени инкубации, разведения сыворотки, титра антисыворотки, концентрации меченого свидетеля. Пластиковые пробирки обрабатывали двумя антисыворотками к фагу ТЗ с различными титрами нейтрализации. Антисыворотка 7: К=150, антисыворотка 8: К=370

1 — антисыворотка 8,1 : 100, 0,05 мкКи метки; 2 — антисыворотка 8,1 : 1000, 0,05 мкКи метки;
3 — антисыворотка 7,1 : 1000, 0,025 мкКи метки; 4 — антясыворотка 8,1 : 1000, 0,025 мкКи меткн.

Аналогичные данные были получены для фага Т4. Соотношение связанный/несвязанный (с/н) меченый фаг отражает воздействие различных факторов. Наилучшие результаты были получены при разведении сыворотки 1:500 или 1: 1000 и при концентрации меченого материала 0,0125 мкКи (около 16000 имп/мин; расчет ведется на 1 пластиковую пробирку). Зависимость от времени исследовали в течение 48-часовой инкубации при температуре 37 °С. Вначале наблюдается быстрое увеличение количества связанной метки, к 12 ч инкубации оно заметно снижается, а затем выходит на плато.

Тест-системы радиоиммунологического анализа на фаги ТЗ и Т4. Пробирки, обработанные специфической АС в разведении 1 : 1000, инкубировали с неизвестным количеством антигенов, растворенного в 0,5 мл калий-фосфатного буфера с рН 7,4 в течение 18 часов при 37°С. После удаления образца с фагом и двукратного отмывания охлажденным до О°С 0,14 М NaCl в каждую пробирку вносят по 0,0125 мкКи меченого антигена, растворенного в 0,5 мл буфера (см. выше). Заключительная инкубация продолжается 24 часа; если ее продолжительность сократить до 22 часов, то это несколько снизит чувствительность анализа. Количество связавшегося меченого антигена определяют после отмывки пробирок раствором NaCl. Измерение радиоактивности проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Эффективность счета 125[I] составляла 54%. Получаемая зависимость носит характер, представленный на рисунках.

Стандартная кривая для фага ТЗ

Стандартная кривая для фага ТЗ

Пластиковые пробирки обрабатывали антисывороткой 1 : 1000.
Количество метки — 0,025 мкКи на пробирку. Специфическая активность 2,3 мкКи/мкг.
1 — внесение меченого свидетеля после удаления неактивного антигена;
2 — совместное введение меченого и немеченого антигенов.

Стандартная кривая для фага Т4

Стандартная кривая для фага Т4

Пластиковые пробирки обрабатывали антисывороткой 1 : 1000.
Количество метки — 0,025 мкКи на пробирку. Специфическая активность 7,2 мкКи/мкг.
1 — меченый свидетель и немеченый антиген внесены одновременно;
2 — меченый свидетель внесён после удаления немеченого антигена.

 

 Линейная зависимость наблюдалась в области концентраций немеченого антигена от 18 до 1800 нг для фага Т3 и от 46 до 4600 нг для фага Т4.

Метод двойных антител

Определяли IgE в крови нормальных и страдающих аллергией пациентов при помощи вторичной преципитирующей АС. В качестве первичного связывающего агента использовали моноспецифическую кроличью антисыворотку к Fc-фрагменту IgE. Чистый IgE получали из плазмы пациента, страдающего IgE продуцирующей миеломой. Специфическая активность меченого антигена составляла 150—250 мкКи/мкг. Все разведения готовили на 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,5) с добавлением 1% БСА.

Определение IgE в сыворотке человека. Стандарт IgE или анализируемую сыворотку доводят БСА-фосфатным буфером до объема 0,5 мл. Специфическую кроличью анти-IgE сыворотку в разведении 1:50 000 вносят аликвотами по 0,1 мл в измерительные сосуды. В таком же объеме вносят 0,1 нг меченого антигена. После инкубации (24—96 ч при 4°С) добавляют 0,15 мл козьей АС к IgG кролика и 0,15 мл разведенной в соотношении 1:20 нормальной сыворотки кролика. Наличие нормальной сыворотки облегчает преципитацию в зоне эквивалентности на последней стадии инкубации. Этот этап занимает 18—72 ч при 4 °С. Надосадочную фракцию после 30-минутного центрифугирования при 3500 g отбрасывают. Процент адсорбированной радиоактивности используется для построения стандартной кривой. В описанных условиях можно определять 1—14 нг IgE. Добавление иммуноглобулин других классов (2 мг IgA, 0,5 мг IgM, 4 мг IgG) вызывало снижение включения метки всего лишь на 6%.

Стандартная кривая для определения IgE методом двойных антител

Стандартная кривая для определения IgE методом двойных антител